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令和２年３月１９日判決言渡
平成３１年（行ケ）第１００１８号審決取消請求事件（以下「甲事件」という。）
平成３１年（行ケ）第１００２９号審決取消請求事件（以下「乙事件」という。）
口頭弁論終結日令和２年１月１４日
判決
甲事件原告シージェイジャパン株式会社
乙事件原告シージェーチェイルジェダン
コーポレーション
甲事件原告及び乙事件原告訴訟代理人弁護士
飯村敏明
同末吉剛
訴訟代理人弁理士山本修
同鶴喰寿孝
訴訟復代理人弁護士高橋聖史
甲事件・乙事件被告味の素株式会社
訴訟代理人弁護士森崎博之
同津城尚子
訴訟代理人弁理士白石真琴
訴訟復代理人弁理士北谷賢次
主文
１甲事件原告及び乙事件原告の請求をいずれも棄却する。
２訴訟費用は甲事件原告及び乙事件原告の負担とする。
３乙事件原告につき，この判決に対する上告及び上告受理申立てのた
めの付加期間を３０日と定める。
事実及び理由
第１請求
特許庁が無効２０１７－８０００２１号事件について平成３１年１月８日
にした審決のうち，特許第３６５１００２号の請求項１～２及び４に係る部分
を取り消す。
第２事案の概要
１特許庁における手続の経緯等
⑴甲事件・乙事件被告（以下「被告」という。）は，平成１１年９月２２日
にした特許出願（特願２０００－５７２３８２号。優先日平成１０年９月２
５日（以下「本件優先日」という。），優先権主張国日本）の一部を分割し
て，平成１６年７月８日，発明の名称を「アミノ酸生産菌の構築方法及び構
築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法」とする発
明について特許出願（特願２００４－２０２１２１号。以下「本件出願」と
いう。）をし，平成１７年３月４日，特許権の設定登録（特許第３６５１０
０２号。請求項の数８。以下，この特許を「本件特許」という。甲１）を受
けた。
⑵甲事件原告は，平成２９年２月２４日，本件特許について特許無効審判を
請求（無効２０１７－８０００２１号事件。以下「本件審判」という。）し
た。
被告は，同年７月７日付けで，請求項１ないし８からなる一群の請求項に
ついて，請求項１，２及び４を訂正し，請求項３及び５ないし８を削除する
旨の訂正請求（以下「本件訂正」という。甲４６）をした。
乙事件原告は，同年１１月２日，本件審判に参加を申請し，本件審判に参
加した。
その後，特許庁は，平成３１年１月８日，本件訂正を認めた上で，「特許
第３６５１００２号の請求項１～２及び４に係る発明についての審判請求は
成り立たない。」，「特許第３６５１００２号の請求項３及び５～８に係る
発明についての審判請求を却下する。」との審決（乙事件原告に対し，出訴
期間として９０日を附加。以下「本件審決」という。）をし，その謄本は，
同月１８日，甲事件原告及び乙事件原告（以下，併せて「原告ら」という。）
に送達された。
⑶甲事件原告は，平成３１年２月１４日，乙事件原告は，同年３月８日，そ
れぞれ，本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起した。
２特許請求の範囲の記載
本件訂正後の特許請求の範囲の請求項１，２及び４の記載は，以下のとおり
である（以下，請求項の番号に応じて，請求項１に係る発明を「本件発明１」
などという。甲４６）。
【請求項１】
コリネ型細菌の染色体上の，
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子のプロモーター配列の－３
５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列，並びに／或い
は
クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴ
ＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地中にＬ－グルタミ
ン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によ
るＬ－グルタミン酸の製造方法。
【請求項２】
ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０
領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するもの，
又は－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有
するものであり，
ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０
領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものである請求項１記載の方法。
３本件審決の理由の要旨
(1)本件審決の理由は，別紙審決書（写し）のとおりである。
その要旨は，請求人（甲事件原告）及び参加人（乙事件原告）の主張する
本件発明１，２及び４に係る無効理由１（本件優先日前に頒布された刊行物
である甲２（Microbiology（1996）142「PromotersfromCorynebacterium
glutamicum:cloning,molecularanalysisandsearchforaconsensus
motif」（訳文：「コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーター：
クローニング，分子解析及びコンセンサスモチーフの探索」））を主引用例
とする進歩性の欠如），無効理由２（本件優先日前に頒布された刊行物であ
る甲５（国際公開第９５／３４６７２号）を主引用例とする進歩性の欠如），
無効理由３（サポート要件違反），無効理由４（実施可能要件違反）などは，
いずれも理由がないというものである。
(2)ア本件審決は，本件発明１には以下の３つの発明が含まれると認定した。
（本件発明１－１）
「コリネ型細菌の染色体上の，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０
領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地
中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを
特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法」に係る発明
（本件発明１－２）
「コリネ型細菌の染色体上の，クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロ
モーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌
を，培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該
培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製
造方法」に係る発明
（本件発明１－３）
「コリネ型細菌の染色体上の，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０
領域にＴＡＴＡＡＴ配列，並びにクエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロ
モーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌
を，培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該
培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製
造方法」に係る発明
イなお，本件発明１－１～１－３における酵素遺伝子及びプロモーター配
列の領域の関係を図示すると，以下のとおりとなる。
本件発明GDHCS
-35領域-10領域-35領域-10領域
1-1TTGTCATATAAT(特定無し)
1-2(特定無し)(特定無し)TATAAT
1-3TTGTCATATAAT(特定無し)TATAAT
⑶本件審決が認定した甲２に記載された発明（以下「甲２発明」という。），
本件発明１－１と甲２発明の一致点及び相違点，本件発明１－２と甲２発明
の一致点及び相違点は，以下のとおりである。
ア甲２発明
「コリネ型細菌の染色体上の，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＧＧＴＣＡ配列及び－１０
領域にＣＡＴＡＡＴ配列を有し，クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロ
モーター配列の－３５領域にＴＧＧＣＴＡ配列及び－１０領域にＴＡＧ
ＣＧＴ配列を有する，コリネ型細菌」の発明
イ本件発明１－１と甲２発明の一致点及び相違点
（一致点）
コリネ型細菌の染色体上の，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に特定の塩基配列及び－１０領
域に特定の塩基配列を有する，コリネ型細菌に係る発明である点。
（相違点１）
本件発明１－１のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の
－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導
入したものであるのに対し，甲２発明のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子の
プロモーター配列の－３５領域にＴＧＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＣ
ＡＴＡＡＴ配列を有するものである点。
（相違点２）
本件発明１－１は，コリネ型細菌を培地で培養し，培地中にＬ－グルタ
ミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵
法によるＬ－グルタミン酸の製造方法の発明であるのに対し，甲２発明は，
コリネ型細菌の発明である点。
ウ本件発明１－２と甲２発明の一致点及び相違点
（一致点）
コリネ型細菌の染色体上の，クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモ
ーター配列の－１０領域に特定の塩基配列を有する，コリネ型細菌に係る
発明である点。
（相違点１）
本件発明１－２のコリネ型細菌は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－
１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したものであるのに対し，甲２発明の
コリネ型細菌は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＧＣ
ＧＴ配列を有するものである点。
（相違点２）
本件発明１－２は，コリネ型細菌を培地で培養し，培地中にＬ－グルタ
ミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵
法によるＬ－グルタミン酸の製造方法の発明であるのに対し，甲２発明は，
コリネ型細菌の発明である点。
⑷本件審決が認定した甲５に記載された発明（以下「甲５発明」という。），
本件発明１－１と甲５発明の一致点及び相違点，本件発明１－２と甲５発明
の一致点及び相違点は，以下のとおりである。
ア甲５発明
「染色体上に存在するα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有
する酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に１又
は２以上の塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じたことにより，
α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損したコリネ型Ｌ－グル
タミン酸生産菌を，培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積
させ，これを該培地から採取することを特徴とするＬ－グルタミン酸の製
造方法」の発明
イ本件発明１－１と甲５発明の一致点及び相違点
（一致点）
コリネ型細菌の染色体上の，遺伝子のプロモーター配列に１又は２以上
の塩基の置換させた配列を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地
中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを
特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法である点。
（相違点）
本件発明１－１のコリネ型細菌は，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＤＨ）遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－
１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したものであるのに対し，甲５発明の
コリネ型細菌は，そのような特定がされていない点。
ウ本件発明１－２と甲５発明の一致点及び相違点
（一致点）
コリネ型細菌の染色体上の，遺伝子のプロモーター配列に１又は２以上
の塩基の置換させた配列を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地
中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを
特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法である点。
（相違点）
本件発明１－２は，クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配
列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したものであるのに対し，甲５
発明は，そのような特定がされていない点。
第３当事者の主張
１取消事由１（本件発明１のサポート要件及び実施可能要件の判断の誤り）に
ついて
⑴取消事由１－１（ＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入について）
ア原告らの主張
本件審決は，本件出願の願書に添付した明細書（以下，図面と併せて「本
件明細書」という。）の実施例等には，コリネ型細菌の染色体上のグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ。以下，単に「ＧＤＨ」ということがあ
る。）遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－
１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有する変異株が，Ｌ－グルタミン酸の収率
を向上させたことが示されており（表５（別紙１を参照）），本件発明１
（本件発明１－１）はかかる内容に対応するものであるから，本件発明１
は，発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された
範囲を超えるものではなく，本件特許請求の範囲の記載は，特許法３６条
６項１号に規定する要件を満たしていないとすることはできない（サポー
ト要件に適合する），また，本件明細書の発明の詳細な説明は，当業者が
本件発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されて
いるといえ，本件発明の詳細な説明の記載は，同条４項１号に規定する要
件を満たしていないとすることはできない（実施可能要件に適合する）旨
判断した。
しかしながら，原告らの実験（甲４９）によれば，本件明細書に記載さ
れた実施例の親株（AJ13029）と異なるコリネ型細菌の菌株（ATCC13869）
を親株として，当該親株と，親株のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に上
記実施例と同一の条件で本件発明１－１と同じ変異を導入した菌株とを
比較したところ，後者のＬ－グルタミン酸生産量は，親株と比較して増加
しておらず，むしろ低下した。
したがって，グルタミン酸の収率を向上させるという発明の課題は，Ｇ
ＤＨ遺伝子のプロモーター配列にのみ特定の配列を導入するという，本件
発明１－１の態様全体にわたって解決できるものではなく，また，本件明
細書の発明の詳細な説明は，グルタミン酸の収率が向上できる程度に十分
かつ明確に記載されていないといえる。
イ被告の主張
原告らの実験（甲４９）は，本件明細書の実施例に記載された親株
（AJ13029）と異なる菌株（ATCC13869）について，培養温度をシフトする
誘導条件を採用している。
しかしながら，本件優先日において，ATCC13869が，AJ13029とは異なり，
培養温度をシフトしてもＬ－グルタミン酸生成が誘導されない菌株であ
ることは，当業者にとって技術常識であった（乙１０，１６）。そのため，
コリネ型細菌を用いてグルタミン酸を生産する当業者であれば，
ATCC13869を培養・誘導するに際し，甲４９に示される条件を採用しない
ことは明らかである。
そして，ATCC13869について，温度シフトではなく，界面活性剤の添加
によってＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－１０領域及び－３５領域に本
件発明１－１の変異を導入した被告の実験（乙１４）によれば，AJ13029を
親株に用いた本件明細書の実施例と同様に，親株と比較してＬ－グルタミ
ン酸生成の顕著な増加を示したことが確認されている。
以上のとおり，原告らの主張は，誤った培養条件を採用した実験結果に
基づくものであって理由がなく，本件審決の判断に誤りはないから，原告
ら主張の取消事由１－１は理由がない。
⑵取消事由１－２（ＣＳ遺伝子のプロモーターへの変異導入について）
ア原告らの主張
本件審決は，①本件明細書の実施例３は，コリネ型細菌の染色体上のＧ
ＤＨ遺伝子のプロモーターに本件発明１－１の変異が導入された変異株
（FGR2）を基にした物であるものの，染色体上のクエン酸合成酵素（ＣＳ。
以下，単に「ＣＳ」ということがある。）遺伝子のプロモーターの－１０
領域のみに変異を有する株（GB02）が，同領域に変異を有しない株（上記
FGR2）に比べて，ＣＳ比活性が１．９倍増強され，Ｌ－グルタミン酸の収
率を向上させたことが記載されており（表１０及び１２（別紙１を参照）），
②また，コリネ型細菌のＣＳ遺伝子のプロモーターに特定の変異を導入す
ることが，Ｌ－グルタミン酸の生産性の向上に寄与することは，当業者で
あれば理解できるから，本件発明１（本件発明１－２）は，発明の課題が
解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるもの
ではなく，サポート要件に適合し，かつ，本件発明の詳細な説明は，当業
者が本件発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載され
ているといえるものであって実施可能要件に適合する旨判断した。
しかしながら，本件明細書の実施例３は，コリネ型細菌の染色体上のＧ
ＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプロモーターに変異を導入して，ＧＤＨ活性
及びＣＳ活性の双方を増強した変異株によるＬ－グルタミン酸の生産性
を示すものであって，ＣＳ遺伝子を単独で増強させた変異株の生産性を示
すものではない。
また，Ｌ－グルタミン酸は，別紙２のとおり，クエン酸回路（トリカル
ボン酸回路。以下「ＴＣＡ回路」という。）という一連の反応によって生
産されるものであり，ＴＣＡ回路において，ＣＳは，オキサロ酢酸とアセ
チルＣｏＡとを縮合してクエン酸を合成する働きを持つ酵素であり，ＧＤ
Ｈは，アンモニアをα－ケトグルタル酸に還元的に固定し，Ｌ－グルタミ
ン酸を生成する反応を促進する酵素である（甲１３）。
ここで，ある反応の生成物が後続の反応の反応物（原料）となり，反応
が順に進行する場合，一連の反応全体の反応速度は，最も遅い反応と実質
上等しくなる（律速段階。甲６６～６８）。そのため，ＴＣＡ回路におい
て，ＣＳの発現のみを強化してクエン酸の生成を促進しても，後続の反応
のいずれかの速度が遅い場合には，Ｌ－グルタミン酸の生成速度は増加し
ないものである。
そして，ＣＳの発現のみを増強してもＬ－グルタミン酸の生産量が増加
しないことは，甲４（Microbiology(1994)140）及び甲３４（特開昭６３－
２１４１８９号公報）にも明示されている。すなわち，甲４では，ＣＳ活
性の増強とＬ－グルタミン酸の生産量との相関に関する過去の研究を引
用して，「Ｃ．グルタミカムのグルタミン酸を分泌する能力は，単にＣＳ
酵素レベルを上昇させるのみでは，促進することはできない。」と記載さ
れ（１８２１頁左欄～右欄），甲３４では，ＣＳ遺伝子の発現は強化する
ものの，ＧＤＨ遺伝子の発現は強化しなかった菌株（801（pAG4003））と
その親株（801）との間で，Ｌ－グルタミン酸の生産量に変化が見られなか
ったことが記載されている（第１３表（別紙３を参照））。
したがって，本件発明１－２のようにＣＳ遺伝子のプロモーター配列に
のみ特定の配列を導入することによって，グルタミン酸の収率を向上させ
るという発明の課題を解決することを，当業者が認識できるものではなく，
また，本件明細書の発明の詳細な説明は，グルタミン酸の収率が向上でき
る程度に十分かつ明確に記載されていないといえる。
イ被告の主張
本件明細書の実施例３には，ＧＤＨ遺伝子の活性が一定の状態で，ＣＳ
遺伝子のプロモーター配列の－１０領域のみに本件発明１－２の変異を
導入して，ＣＳ活性を適度な範囲に調節すると，グルタミン酸生産量が増
大することが示されている。
また，ＴＣＡ回路の回転の強さは，回路に含まれる物質の量に依存する。
そこで，例えば，ＣＳ遺伝子の活性が高まってＣＳ酵素による反応産物が
増加すれば，回路は強く回転することになるため，ＧＤＨ遺伝子の活性を
高めずとも，回路の回転で生産されるグルタミン酸は増加する。
そうすると，上記知見を有する当業者であれば，本件明細書の記載から，
ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の変異と組み合わせずとも，ＣＳ遺伝子
のプロモーター配列の変異によってその活性を適度に増強することで，グ
ルタミン酸生産能の向上に寄与することを理解できる。
なお，甲４及び甲３４に記載されたＣＳ遺伝子の発現の増強は，プラス
ミド導入によるものであるところ，ある遺伝子をプラスミドで増強させた
結果から，染色体上の同遺伝子のプロモーター配列を改変させた結果は予
測し得ないものであるから，甲４及び３４の記載は，本件発明１－２によ
る上記効果を何ら否定するものではない。
以上によれば，本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張の取消事由１
－２は理由がない。
⑶取消事由１－３（プロモーター－３５領域及び－１０領域の周辺領域につ
いて）
ア原告らの主張
本件審決は，本件発明１は，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子のプロモーター
の－３５領域及び／又は－１０領域に特定の配列の変異を導入したコリ
ネ型細菌変異株を用いて，Ｌ－グルタミン酸の収率を向上させたＬ－グル
タミン酸の製造方法を提供するものであって，－３５領域及び－１０領域
の周辺領域の配列や長さを発明特定事項とするものではなく，これらの領
域の周辺領域の配列や長さについては，本件明細書の記載（【００１７】，
【００１８】，【００２２】，【００２５】～【００４８】，表５，６，
１０及び１２）及び技術常識に基づき，当業者であれば容易に理解するこ
とができるから，本件発明１はサポート要件に適合し，また，本件明細書
の発明の詳細な説明は実施可能要件に適合する旨判断した。
しかしながら，本件発明１では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５
領域及び－１０領域に特定の配列を導入し，並びに／あるいはＣＳ遺伝子
の－１０領域に特定の配列を導入することが規定されているものの，－３
５領域と－１０領域の間の配列，－３５領域の上流領域及び－１０領域の
下流領域は何ら特定されていないため，これらの領域には，いずれの配列
及び長さを有するものも包含される。
一方，－３５領域と－１０領域の間の配列や長さは，プロモーター活性
に大きく影響することが知られており（甲２６（１頁１２行～１７行），
甲２７（４頁１５行～２２行），甲２８（実施例２，表１），甲３２（１
９１頁（ｂ）及び（ｃ），図２及び３）），コリネ型細菌においても，プ
ロモーターの－３５領域と－１０領域の間の領域が重要であると報告さ
れている（甲２（１３０６頁左欄３９行～５９行））。
また，－３５領域の上流領域及び－１０領域の下流領域の配列や長さが，
プロモーター活性に大きく影響することも知られており（甲３２（１９１
頁（ｄ），図２～５）），コリネ型細菌においても，プロモーターの－３
５領域の上流領域が保存され，重要性が示唆されている（甲２（１３０６
頁左欄３９行～５９行））。
ところが，－３５領域と－１０領域の間の配列，－３５領域の上流領域
及び－１０領域の下流領域の具体例として本件明細書の実施例に示され
ているのは，それぞれ，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターに関する，配列番号
１における「TATCTGCGACACTGC」（15bp），同「TTAATTCTTTG」（11bp）及
び同「TTGAACGT」（8bp）のみであって（【００２５】），ＣＳ遺伝子に関
するものは示されておらず，上記配列を採用すべきことを示唆するような
記載もない。そして，本件明細書のその他の部分には，これらの領域に関
する記載は見当たらず，プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺
領域の配列や長さがプロモーター活性に影響を与えない範囲が，技術的背
景として明らかであったわけでもないから，これを当業者が適宜定めるこ
とはできない。
以上によれば，本件明細書の実施例及びその他の記載並びに技術常識を
参照しても，本件発明１におけるように，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子の
プロモーターの－３５領域と－１０領域の間の配列，－３５領域の上流領
域及び－１０領域の下流領域を任意の配列や長さにした場合に，Ｌ－グル
タミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない。
したがって，本件発明１はサポート要件に適合するものとはいえず，同
様の理由により，本件明細書の発明の詳細な説明は実施可能要件に適合す
るものとはいえない。
イ被告の主張
本件発明１は，目的遺伝子のプロモーターの特異的領域である－３５領
域及び／又は－１０領域に特定の配列の変異を導入し，目的遺伝子の発現
量の適度な強化及び調節を行うことで，Ｌ－グルタミン酸を高収率で生産
する能力を有するコリネ型細菌変異株を提供するものであって，－３５領
域及び－１０領域の周辺領域の長さや配列を発明特定事項とするもので
はない。
そして，原告らが挙げる甲２６等に，プロモーターの－３５領域及び－
１０領域の周辺領域の配列や長さがプロモーター活性に影響を与えるこ
とが記載されていたとしても，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子のプロモーター
の－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列や長さは，本件明細書の記
載及び技術常識に基づき，Ｌ－グルタミン酸の収率に影響を与えない範囲
で当業者が適宜定めることができる。
なお，ＧＤＨ遺伝子の－３５領域と－１０領域の間の配列については，
本件明細書の【００２５】だけでなく，【００３２】（表６）にも記載さ
れている。また，野生型のＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子の配列は，－３５
領域と－１０領域の周辺領域も含めて公知であった。
以上によれば，本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張の取消事由１
－３は理由がない。
２取消事由２（甲２を主引用例とする本件発明１の進歩性の判断の誤り）につ
いて
⑴取消事由２－１（本件発明１－１について）
ア原告らの主張
本件審決は，①甲２，４～８及び３４の記載は，コリネ型細菌の染色体
上のＧＤＨ遺伝子等のグルタミン酸生合成系遺伝子のプロモーター配列の
－３５領域及び－１０領域の塩基配列をコリネ型細菌のコンセンサス配列
に改変することや，コンセンサス配列に基づき上記各領域の塩基配列を改
変することを示唆する記載であるとはいえない，②また，技術常識ないし
周知事項を示す証拠として原告らが提出した甲３，９～１２，１６～１９，
２３～２８，３０～３３及び３５にも，上記①の各領域の塩基配列をコリ
ネ型細菌のコンセンサス配列に改変することや，コンセンサス配列に基づ
き上記各領域の塩基配列を改変することの動機付けとなるような記載はな
いから，甲２，４～８及び３４の記載及び本件優先日前の周知事項に基づ
いても，甲２発明のコリネ型細菌において，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター
配列の－３５領域及び－１０領域の塩基配列の一部を置換して，本件発明
１－１の構成とすることは，当業者が容易に想到し得ることとはいえない
旨判断した。
しかしながら，以下のとおり，甲２発明及び甲２中の示唆に基づいて，
又は甲２発明に甲５，甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発明１
－１の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
(ア)－１０領域について
ａ主引用例（甲２）中の示唆
(a)技術常識
前記１⑵アのとおり，Ｌ－グルタミン酸は，ＴＣＡ回路という一
連の反応によって生産されるものである。そして，Ｌ－グルタミン
酸の生産を増強するためには，Ｌ－グルタミン酸に至るまでの各反
応に関与する酵素（ＣＳ，ＧＤＨ，ＩＣＤＨ等）の発現を強化する
ことが望ましいことは，本件優先日前において技術常識であった
（甲５（１１頁１１行～２０行），甲１１（３頁左上欄５行～１０
行），甲３４（３頁右下欄））。
また，E.coli（大腸菌）において，プロモーターの－１０領域及
び－３５領域をコンセンサス配列に変更ないし近づけることによ
って，目的遺伝子の発現を強化できることも，本件優先日前におい
て技術常識であった（甲６，甲９（１１２０頁右欄５行～９行），
甲１７（Abstract），甲１８（図１～２，８０４頁左欄１２行～２
０行），甲１９（Abstract，６２２９頁右欄最終行～６２３０頁左
欄８行），甲２７（４頁１行～４行，７頁２４行～２８行），甲３
１（Abstract）等）。
⒝甲２の記載
甲２には，コリネ型細菌とE.coliのコンセンサス配列が同等で
あることが示されている（１２９７頁Abstract１１行～１８行）。
また，甲２には，コリネ型細菌のプロモーターの－１０領域のコ
ンセンサス配列が「TA.aaT」であること，この３番目の塩基「.」は，
突出して頻度の高いものは存在しないものの，「T」が33％（11/33）
を占めており，相対的に最も頻度の高い塩基であることが記載され
ている（Abstract，Table２）。
加えて，本件優先日前において，E.coli等の細菌のプロモーター
－１０領域のコンセンサス配列は「TATAAT」であり，３番目の塩基
は「T」であること（甲２（Table2）），－１０領域の配列が「TATAAT」
であるプロモーター（例えば，tac，lacUV5）が，コリネ型細菌で強
力に機能し，下流の遺伝子の発現を増強することが知られていた
⒞小括
以上によれば，前記⒝の甲２の記載は，当業者に対し，甲２発明
のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域（CATAAT）の１番
目の塩基「C」を「T」に変異して，コンセンサス配列，すなわち本
件発明１－１の構成（「TATAAT」）とすることを示唆するものとい
える。
ｂ副引用例について
(a)甲５の記載
甲５には，コリネ型細菌によるＬ－グルタミン酸の生産性を向上
させるためには，Ｌ－グルタミン酸生合成系遺伝子を増強すること
が有利であり，その具体的な手段として，ＴＣＡ回路に関わるＧＤ
Ｈ遺伝子，ＣＳ遺伝子等の発現を増強することが記載されている
（１１頁１１行～２０行）。
さらに，甲５には，目的遺伝子の発現を強化するには，当該遺伝
子をコリネ型細菌で機能する強力なプロモーターの下流に連結す
ればよいことが記載され，そのようなプロモーターとして，大腸菌
のlac，lacUV5，tac，trpプロモーター等が例示されている（１２
頁９行～１６行）。そして，上記の大腸菌のlacプロモーター等は，
－１０領域に「TATAAT」配列を有する（甲７）。
加えて，甲５には，目的遺伝子を相同組換えによって染色体上へ
固定することも記載されている（９頁２９行～１０頁１３行）。し
かも，本件優先日当時，目的遺伝子の発現をプラスミドＤＮＡ上に
より増強する技術には，目的遺伝子や菌株によっては，脱落，不十
分な発現，過剰発現による菌の生育や物質への悪影響といった問題
が生じる場合があること，この課題を解決するための手段として，
相同組換えにより目的遺伝子を染色体上へ固定する方法が，既に知
られていた（甲５（９頁最終行～１０頁１３行），甲１０（【００
０３】，【０００４】））。また，コリネ型細菌のＣＳ遺伝子につ
いては，その発現増強をプラスミドにより行うと，過剰発現により
菌の生育が悪くなったことから（甲４（１８２０頁右欄３２行～３
６行）），染色体上での変異導入により解決すべき具体的課題が存
在することも知られていた。
そのため，Ｌ－グルタミン酸の生産に当たり，目的遺伝子（とり
わけ，ＣＳ遺伝子）の発現のためにプラスミドではなく染色体上へ
の変異導入を行うことは，当業者が当然に採用する手段であった。
以上によれば，Ｌ－グルタミン酸の生産量を向上させる目的で，
ＴＣＡ回路に関わるＧＤＨ遺伝子の発現を強化するため，甲２発明
に対し，甲５記載のlacプロモーター等の－１０領域（「TATAAT」）
を適用し，甲２発明の染色体上のプロモーターに変異を導入して，
相違点１に係る本件発明１－１の構成を採用することは，当業者が
容易に想到し得たものである。
⒝甲６の記載
甲６には，E.coliのプロモーター配列の－１０領域のコンセンサ
ス配列が「TATAAT」であること，E.coliのプロモーター配列の－１
０領域を「TACAAT」から上記コンセンサス配列に変異させたことに
より，活性が７倍上昇したことが記載されている（８７５頁左欄
Abstract４行～１０行）。
そして，前記ａ(a)のとおり，本件優先日前において，コリネ型細
菌において，ＴＣＡ回路に関与する複数の酵素の遺伝子（例えば，
ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子）の発現を強化することによって，Ｌ
－グルタミン酸の生産性が向上することが知られており，また，コ
リネ型細菌とE.coliとの間で，プロモーターの機能と構造に共通
性があり転用が可能であることも知られていた（甲２（１３０５頁
右欄１１行～２４行，１３０６頁左欄１８行～３８行），甲５（１
２頁９行～１６行），甲１６（Abstract（６０７頁），結果（６０
８頁），Table１（６１０頁）），甲２０（３頁左上欄５行～右上欄），
甲２１（２頁左上欄１２行～右上欄８行），甲２２（請求項８，１
２）等）。
以上によれば，Ｌ－グルタミン酸の生産量を向上させる目的で，
ＴＣＡ回路に関わるＧＤＨ遺伝子の発現を強化するため，甲２発明
に対し，甲６記載の発明を適用し，甲２発明の染色体上のプロモー
ターに変異を導入して，相違点１に係る本件発明１－１の構成を採
用することは，当業者が容易に想到し得たものである。
⒞甲８の記載
甲８には，コリネ型細菌内で機能するプロモーターの配列（－３
５領域「TAGACA」，－１０領域「TATAAT」）の発明や，プロモータ
ー配列の－１０領域を「TATAAT」にすることにより，目的遺伝子の
発現が１４倍上昇することが記載されている（請求項１，実施例２，
実施例３）。
そして，前記ａ(a)のとおり，本件優先日前において，コリネ型細
菌において，ＴＣＡ回路に関与する複数の酵素の遺伝子（例えば，
ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子）の発現を強化することによって，Ｌ
－グルタミン酸の生産性が向上することが知られていた。
以上によれば，Ｌ－グルタミン酸の生産量を向上させる目的で，
ＴＣＡ回路に関わるＧＤＨ遺伝子の発現を強化するため，甲２発明
に対し，甲８記載の発明を適用し，甲２発明の染色体上のプロモー
ターに変異を導入して，相違点１に係る本件発明１－１の構成を採
用することは，当業者が容易に想到し得たものである。
ｃ相違点の容易想到性
以上によれば，コリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の
－１０領域を本件発明１－１の構成「TATAAT」に改変することは，当
業者が甲２発明及び甲２の示唆に基づき，又は，甲２発明及び甲５，
甲６若しくは甲８記載の発明に基づいて，容易に想到し得たものであ
る。
(イ)－３５領域について
ａ前記(ア)ａ(a)のとおり，本件優先日前において，Ｌ－グルタミン酸
の生産を増強するためには，Ｌ－グルタミン酸に至るまでの各反応に
関与する酵素（ＣＳ，ＧＤＨ，ＩＣＤＨ等）の発現を強化することが
望ましいこと，E.coliにおいて，プロモーターの－１０領域及び－３
５領域をコンセンサス配列に変更ないし近づけることによって，目的
遺伝子の発現を強化できることは，技術常識であった。
ｂ野生型コリネ型細菌のプロモーターの－３５領域のコンセンサス配
列は「TTGCCA」であり，１番目～３番目の塩基は「TTG」である。そし
て，コリネ型細菌を含む複数の細菌において，プロモーター－３５領
域の１番目～３番目の塩基「TTG」の保存性が高いことが知られていた
（甲２（Table2），甲６（introduction））。
そうすると，当業者が野生型コリネ型細菌のプロモーター－３５領
域の変異を試みる場合，１番目～３番目の塩基については保存性の高
い「TTG」を採用するはずである。
ｃ以上によれば，Ｌ－グルタミン酸の生産性を向上させるために，各
酵素の発現を強化する一環として，甲２発明のコリネ型細菌における
野生型ＧＤＨ遺伝子のプロモーター－３５領域の１番目～３番目の塩
基を保存性の高い「TTG」にするために，２番目の塩基「G」を「T」に
変異して，本件発明１－１の構成（「TTGTCA」）とすることは，当業
者が容易に想到し得た事項である。
(ウ)本件発明１－１の効果
本件明細書の記載によれば，野生型の親株（AJ13029）のＧＤＨ遺伝子
のプロモーター配列に変異を導入して本件発明１－１の構成とした菌株
（FGR2（実施例２））のＬ－グルタミン酸生産量は，親株の１．１５倍
に過ぎない（表５及び６（別紙１を参照））。
そして，従来技術でも，ＧＨＤ遺伝子の発現の強化により，Ｌ－グル
タミン酸生産量が１．２０倍に増加することが知られていた（甲３４）。
以上によれば，相違点１に係る本件発明１－１の構成を採用すること
による効果は，顕著なものとはいえない。
イ被告の主張
(ア)－１０領域について
ａ主引用例（甲２）中の示唆について
(a)技術常識
Ｌ－グルタミン酸の生産を増強するために，Ｌ－グルタミン酸に
至るまでの各反応に関与する酵素（ＣＳ，ＧＤＨ，ＩＣＤＨ等）の
活性をどの程度増強すればよいかについては，本件優先日当時，明
らかではなかった。
また，E.coliにおいて，プロモーターの－１０領域及び－３５領
域をコンセンサス配列に変更ないし近づけることによって，目的遺
伝子の発現を強化できることが，本件優先日前において技術常識で
あったとはいえない。この点に関し原告らが提出する証拠（甲６，
９，１７～１９，２７，３１）には，E.coliのプロモーターの－３
５領域及び－１０領域の配列が，コンセンサス配列に近づく程活性
が高まることは記載されていない。
E.coliに関しても，プロモーター配列の－３５領域及び－１０領
域の配列とコンセンサス配列との類似性が高まることで，プロモー
ター活性の向上が必ず引き起こされるとは考えられていなかったも
のである（乙７の１～７の３）。
⒝甲２の記載
甲２には，単にE.coli等と，コリネ型細菌のTSサイトから約３
５塩基対上流及び約１０塩基対上流のモチーフの位置及びモチーフ
自体が比較可能であるという程度のことが示されているに過ぎない。
また，甲２には，コリネ型細菌のプロモーターの－１０領域のコ
ンセンサス配列が「TA.aaT」であることが記載されているが，この
３番目の塩基「.」は，塩基が不安定であることを示し，また，小文
字で記載される塩基は，甲２で検討した多数の酵素の各プロモータ
ーにおいて，保存性の低い塩基であることを示している。
なお，甲２のTable2に示されるC.グルタミカムプロモーターの
各塩基の保存割合は，Fig.1に示される３３個のプロモーター中の
頻度から計算しているが，これは，Fig.1の－１０領域の３番目の
塩基が「T」である数と，「G」である数を数え間違え，「T」を１１
個，「G」を９個として算出した割合と考えられる。しかしながら，
実際には，Fig.1に示される－１０領域の３番目の塩基の「T」は１
０個であるから，その保存割合は３０％（10/33）であり，また，「G」
も実際は１０個であるから同様に３０％であって，「T」が相対的に
最も頻度の高い塩基というわけでもない。
また，本件優先日当時，コリネ型細菌の遺伝子発現のためのプロ
モーターの配列構造についての研究は進んでおらず，大腸菌や枯草
菌のような他の産業用微生物とは異なり，公知ではなかったもので
あり，コリネ型細菌のＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域は，
必ずしも甲２に開示される配列に確定していなかった（甲３，４，
乙８）。
甲２には，コリネバクテリウム・グルタミカムの複数の遺伝子の
プロモーターについて，－３５領域及び－１０領域の塩基配列を解
析した結果が記載されているだけであって，コリネ型細菌の染色体
上の遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域の塩
基配列をコリネ型細菌のコンセンサス配列に改変することや，コン
センサス配列に基づきこれらの領域の塩基配列を改変することを
示唆する記載はない。
かえって，甲２には，コリネ型細菌において，プロモーター活性
と，各プロモーターの－３５領域及び－１０領域とコンセンサス配
列との類似性との間に相関が確認できなかったことが記載されて
いる（１３０６頁右欄下から２行～１３０７頁左欄６行）。
⒞小括
以上によれば，当業者が，甲２の記載に基づき，コリネバクテリ
ウム・グルタミカムの多数の遺伝子のうち，特にＧＤＨ遺伝子のプ
ロモーター配列を改変しようとする動機付けがあったとはいえな
い。
ｂ副引用例について
(a)甲５の記載
甲５は，α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α－ＫＧＤＨ）
活性が欠失したコリネ型細菌及び当該菌を用いたＬ－グルタミン
酸の製造法等に関する文献である（請求項１，２等）。
そして，甲５には，α－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型細菌を
得る方法として，染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラ
スミドを用いて相同性組換えを起こすことにより，変異が導入され
て改変又は破壊された遺伝子が，染色体上の正常な遺伝子と置換さ
れた菌株を取得することができる旨が記載されているが，かかる記
載は，α－ＫＧＤＨ活性を欠損させる手段として記載されているだ
けで，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子等のグルタミン酸生
合成系遺伝子に変異を導入する手段として記載されているわけで
はない。
また，甲５には，遺伝子自体を改変又は破壊する手段として，上
記の相同性組換えを開示しているに留まり，遺伝子のプロモーター
の特定の領域を変異させることや，染色体上にもともと存在する遺
伝子のプロモーターの特定の領域を変異させて発現を適度に調整
するという解決手段については，開示も示唆もない。
なお，甲５は，α－ＫＧＤＨ活性の欠失とともに，グルタミン酸
生合成系遺伝子を強化し得ることを開示し，そのような遺伝子とし
て，他の多数の遺伝子に加えてＣＳ及びＧＤＨを例示するが，これ
らの遺伝子を染色体から取得し，これをコリネ型細菌で利用可能な
ベクターに連結した後，目的遺伝子の発現を増強したい場合には，
ベクター上の遺伝子を強力なプロモーターの下流に連結すること
ができることを開示するにとどまる（１１頁２１行～１２頁４行，
１２頁９行～１６行）。
したがって，甲５には，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子
等のグルタミン酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に関し，その
－３５領域及び－１０領域の塩基配列を改変することの開示も示
唆もない。
⒝甲６の記載
甲６には，大腸菌の特定の遺伝子のプロモーターについての結果
が記載されているだけであって，コリネバクテリウム・グルタミカ
ムのプロモーターのコンセンサス配列に関する記載はない。
また，E.coliとC.グルタミカムとではコンセンサス配列が異な
り，コリネ型細菌にE.coliのコンセンサス配列と一致させる変異
を導入する動機付けもない。
そもそも，前記ａ(a)のとおり，E.coliにおいてさえも，目的遺
伝子のプロモーター配列をコンセンサス配列に変更した際に，必ず
しも，遺伝子の活性が増強されるとはいえなかった。
このような状況下において，E.coliに関する甲６の開示を，コリ
ネ型細菌に適用する動機付けはなく，コリネ型細菌にE.coliのコ
ンセンサス配列と一致させる変異を導入して，相違点１に係る本件
発明１－１の構成とすることを想到するのは，容易でない。
⒞甲８の記載
甲８は，特定の配列を有するプロモーターがコリネ型細菌内で機
能することを示すに過ぎず，コンセンサス配列とは無関係の文献で
ある。また，甲８は，コリネ型細菌内で機能するプロモーターの配
列として特定の配列を採用した結果，目的遺伝子の発現が１４倍に
上昇したことを示すものではない。
本件発明は，目的遺伝子の発現を適度に増加して，グルタミン酸
を高収率で得る発明であり，目的遺伝子の発現と生成物の収率が連
動しているわけではない。また，ある微生物のプロモーターが，他
の微生物のプロモーターとして機能する例が知られていることと，
そのプロモーターが他の微生物においてコンセンサス配列である
ことは無関係である。
加えて，甲８でブレビバクテリウム菌株に導入されている遺伝子
（CAT）は，その株に全く存在しない外来遺伝子であるから，甲８の
記載は，染色体上のＧＤＨ遺伝子等のプロモーター配列の－１０領
域の塩基配列を改変することを示唆する記載ではない。
(イ)－３５領域について
ａ前記(ア)と同様の理由により，当業者が，甲２の記載に基づき，コ
リネバクテリウム・グルタミカムの多数の遺伝子のうち，特にＧＤＨ
遺伝子のプロモーター配列を改変しようとする動機付けがあったとは
いえず，また，甲５，甲６及び甲８には，コリネ型細菌の染色体上の
ＧＤＨ遺伝子等のグルタミン酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に
関し，その－３５領域の塩基配列を改変することの開示や示唆はない。
ｂまた，甲２には，①－３５領域のコンセンサス配列は，E.coliが
「TTGACA」であり，C.グルタミカムでは「ttGcca」であること，②E.coli
の－３５領域では，１番目～３番目の「TTG」の保存性が高い一方，C.
グルタミカムの－３５領域では，「TTG」のうち，１番目の「T」と２
番目の「T」は，いずれも保存性が４８％であり，６塩基の中でも５番
目の「C」（４５％）と並んで最も保存性が低いことが示されている
（Table2）。
そうすると，仮に，甲２発明のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３
５領域の配列（TGGTCA）を，コンセンサス配列の各塩基の保存性の高
さを考慮して改変するとしても，コンセンサス配列（ttGcca）と相違
する塩基（２番目の「G」及び４番目の「T」）のうち，保存性のより
高い４番目の塩基（Table2）を維持して「TGGCCA」とするはずである
から，相違点１に係る本件発明１－１の構成に至るものではない。
(ウ)本件発明１－１の効果
アミノ酸生産菌の染色体上でプロモーター配列を改変することにより
アミノ酸の収率を実際に向上させた例は，本件発明以前に存在せず，ま
た，本件発明は，目的遺伝子の発現を最適な発現量に調節することによ
り，目的とするアミノ酸であるＬ－グルタミン酸の収率を高めるのみな
らず，目的とするアミノ酸以外の副生を抑制することができるという従
来技術から全く予想することができなかった顕著なものである。
(エ)小括
以上によれば，甲２発明及び甲２の記載中の示唆に基づいて，又は甲
２発明に甲５，甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発明１－１
の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得たものであるとはい
えない。
したがって，この点に関する本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主
張の取消事由２－１は理由がない。
⑵取消事由２－２（本件発明１－２について）
ア原告らの主張
本件審決は，①甲２，４～８及び３４の記載は，コリネ型細菌の染色体
上のＣＳ遺伝子等について，グルタミン酸生合成系遺伝子のプロモーター
配列の－１０領域における塩基配列をコリネ型細菌のコンセンサス配列に
改変することや，コンセンサス配列に基づき上記領域の塩基配列を改変す
ることを示唆する記載であるとはいえない，②また，技術常識ないし周知
事項を示す証拠として原告らが提出した甲３，９～１２，１６～１９，２
３～２８，３０～３３及び３５にも，上記①の各領域の塩基配列をコリネ
型細菌のコンセンサス配列に改変することや，コンセンサス配列に基づき
上記領域の塩基配列を改変することの動機付けとなるような記載はないか
ら，甲２，４～８及び３４の記載及び本件優先日前の周知事項に基づいて
も，甲２発明のコリネ型細菌において，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の
－１０領域における塩基配列の一部を置換して，本件発明１－２の構成と
することは，当業者が容易に想到し得ることとはいえない旨判断した。
しかしながら，甲２発明及び甲２中の示唆に基づいて，又は甲２発明に
甲５，甲６若しくは甲８記載の内容を適用して，相違点１に係る本件発明
１－２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
その理由は，前記⑴ア(ア)と同様である。
なお，本件発明１－２の効果に関し，本件明細書の実施例３では，ＧＤ
Ｈ遺伝子のプロモーターを本件発明１－１の構成とした菌株（FGR2）に対
し，更にＣＳ遺伝子のプロモーターを本件発明１－２の構成とした菌株
（GB02）が比較されているが，後者のＬ－グルタミン酸の生産性は，前者
の約１．１倍に過ぎない。
そして，従来技術でも，ＣＳ遺伝子の発現の強化により，Ｌ－グルタミ
ン酸生産量が１．２３倍に増加することが知られていた（甲３４）。
以上によれば，相違点１に係る本件発明１－２の構成を採用することに
よる効果は，顕著なものとはいえない。
また，前記１⑵アのとおり，ＧＤＨ遺伝子の発現を強化することなく，
ＣＳ遺伝子の発現のみを強化した例は，本件明細書に記載されていないた
め，本件発明１－２の効果は，本件明細書では実証されていない。
そのため，相違点１に特段の技術的意義はなく，ＣＳ遺伝子のプロモー
ターの－１０領域に変異を導入して本件発明１－２の構成とすることは，
当業者が適宜変更できる事項に過ぎない。
イ被告の主張
前記⑴イ(ア)と同様の理由により，甲２発明及び甲２中の示唆に基づい
て，又は甲２発明に甲５，甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発
明１－２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得たものである
とはいえない。
なお，本件発明１－２が顕著な効果を奏するものであることは，前記⑴
イ(ウ)のとおりである。また，本件明細書の記載から，ＧＤＨ遺伝子のプ
ロモーター配列の変異と組み合わせずとも，ＣＳ遺伝子のプロモーター配
列の変異によってその活性を適度に増強することで，グルタミン酸生産能
の向上に寄与することを理解できることは，前記１⑵イのとおりである。
したがって，この点に関する本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張
の取消事由２－２は理由がない。
⑶取消事由２－３（本件発明１－３について）
ア原告らの主張
本件審決は，本件発明１－３は，本件発明１－１に更なる限定を加えた
発明であるから，本件発明１－１が当業者が容易に発明をすることができ
たものであるとはいえない以上，本件発明１－３も，当業者が容易に発明
をすることができたものであるとはいえない旨判断した。
したがって，本件発明１－３についても，前記⑴アと同様の理由により，
本件審決は，違法なものとして取り消されるべきである。
イ被告の主張
前記⑴イ及び⑵イのとおり，甲２発明及び甲２中の示唆に基づいて，又
は甲２発明に甲５，甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発明１－
１及び本件発明１－２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得
たものであるとはいえないから，本件発明１－３についても，当業者が容
易に想到し得たものであるとはいえない。
したがって，この点に関する本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張
の取消事由２－３は理由がない。
３取消事由３（甲５を主引用例とする本件発明１の進歩性の判断の誤り）につ
いて
⑴取消事由３－１（本件発明１－１について）
ア原告らの主張
(ア)甲５発明の認定及び本件発明１－１と甲５発明の対比の誤り
本件審決は，前記第２の３⑷ア及びイのとおり，甲５発明並びに本件
発明１－１と甲５発明の一致点及び相違点を認定した。
しかしながら，以下のとおり，本件審決における甲５発明の認定及び
本件発明１－１と甲５発明の一致点及び相違点の認定には誤りがある。
ａ甲５に記載された発明
(a)前記２⑴ア(ア)ｂ(a)のとおり，当業者であれば，甲５には，Ｌ
－グルタミン酸の生産量の向上を目的として，ＣＳ遺伝子及びＧＤ
Ｈ遺伝子を増強させる手段が記載されていると理解するところ，さ
らに，甲５には，目的遺伝子を相同組換えによって染色体上へ固定
することも記載されており，Ｌ－グルタミン酸の生産に当たり，目
的遺伝子（とりわけ，ＣＳ遺伝子）の発現のためにプラスミドでは
なく染色体上への変異導入を行うことは，当業者が当然に採用する
手段であった。
⒝以上によれば，甲５に記載された発明は，以下のとおり認定され
るべきである（以下「甲５発明’」という。）。
「コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＤＨ）又はクエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列に
変異を導入したコリネ型細菌を培地で培養し，培地中にＬ－グルタ
ミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とす
る発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法。」
ｂ本件発明１－１と甲５発明’との対比
本件発明１－１と甲５発明’との対比によると，相違点は，以下の
とおり認定されるべきである（以下「相違点１’」という。下線部は，
本件審決が認定した相違点（前記第２の３⑷イ）と異なる箇所である。）。
「本件発明１－１のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター
配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ
配列を導入したものであるのに対し，甲５発明’のコリネ型細菌は，
ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－
３５領域及び－１０領域の配列が特定されていない点。」
ｃ相違点１’の容易想到性
前記２⑴アと同様の理由により，相違点１’に係る本件発明１－１
の構成は，当業者が容易に想到することができたものである。
(イ)相違点の容易想到性の判断の誤り
本件審決は，甲２を主引用例とする本件発明１－１の進歩性の判断（前
記２⑴ア）と同様の理由により，甲２，４～８及び３４の記載及び本件
優先日前の周知事項に基づいても，甲５発明のコリネ型細菌において，
ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域の塩基配
列の一部を置換して，本件発明１－１の構成とすることは，当業者が容
易に想到し得ることとはいえない旨判断した。
しかしながら，前記２⑴ア(ア)と同様の理由により，本件審決が認定
した相違点に係る本件発明１－１の構成は，当業者が容易に想到するこ
とができたものである。また，上記相違点に係る本件発明１－１の構成
を採用することによる効果は，顕著なものとはいえない（前記２⑴ア
(ウ)）。
したがって，本件審決の上記判断には誤りがある。
イ被告の主張
(ア)甲５発明の認定及び本件発明１－１と甲５発明の対比について
ａ甲５に記載された発明
(a)前記２⑴イ(ア)ｂ(a)のとおり，甲５は，α－ＫＧＤＨ活性の欠
失とともに，グルタミン酸生合成系遺伝子を強化し得ることを開示
し，そのような遺伝子として，他の多数の遺伝子に加えてＣＳ及び
ＧＤＨを例示するが，これらの遺伝子を染色体から取得し，これを
コリネ型細菌で利用可能なベクターに連結した後，目的遺伝子の発
現を増強したい場合には，ベクター上の遺伝子を強力なプロモータ
ーの下流に連結することができることを開示するにとどまるもので
あって，コリネ型細菌の染色体上にあるＧＤＨ遺伝子等グルタミン
酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に関し，その－３５領域及び
－１０領域の塩基配列を改変することの開示や示唆はない。
⒝以上によれば，甲５に甲５発明’が記載されているものとは認め
られず，本件審決における甲５発明の認定に誤りはない。
ｂ本件発明１－１と甲５発明との対比
前記ａのとおり，本件審決における甲５発明の認定に誤りはない。
そして，本件発明１－１と甲５発明とを対比すると，本件審決が認
定したとおりの一致点及び相違点が認められるものであって，本件審
決の認定に誤りはない。
(イ)相違点の容易想到性の判断について
前記２⑴イ(ア)と同様の理由により，本件審決が認定した相違点に係
る本件発明１－１の構成は，甲５と他の従来技術を組み合わせても，当
業者が容易に想到することができたものであるとはいえない。また，そ
の効果も従来予測し得なかった顕著なものである（前記２⑴イ(ウ)）。
したがって，これと同旨の本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張
の取消事由３－１は理由がない。
⑵取消事由３－２（本件発明１－２について）
ア原告らの主張
(ア)甲５発明の認定及び本件発明１－２と甲５発明の対比の誤り
ａ本件審決は，前記第２の３⑷ア及びウのとおり，甲５発明並びに本
件発明１－２と甲５発明の一致点及び相違点を認定した。
しかしながら，前記⑴ア(ア)のとおり，本件審決における甲５発明
の認定には誤りがあり，甲５に記載された発明として，甲５発明’を
認定するのが相当である。
ｂそして，本件発明１－２と甲５発明’とを対比すると，相違点は，
以下のとおり認定されるべきである（以下「相違点１’」という。下
線部は，本件審決が認定した相違点（前記第２の３⑷ウ）と異なる箇
所である。）。
「本件発明１－２のコリネ型細菌は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配
列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したものであるのに対し，
甲５発明’のコリネ型細菌は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列に変異
が導入されているものの，－１０領域の配列が特定されていない点。」
ｃ相違点１’の容易想到性
前記２⑵アと同様の理由により，相違点１’に係る本件発明１－２
の構成は，当業者が容易に想到することができたものである。
(イ)相違点の容易想到性の判断の誤り
本件審決は，甲２を主引用例とする本件発明１の進歩性の判断（前記
２⑴ア）と同様の理由により，甲２，４～８及び３４の記載及び本件優
先日前の周知事項に基づいても，甲５発明のコリネ型細菌において，Ｃ
Ｓ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域の塩基配列の一部を置換して，
本件発明１－２の構成とすることは，当業者が容易に想到し得ることと
はいえない旨判断した。
しかしながら，以下のとおり，本件審決の上記判断には誤りがある。
ａ主引用例（甲５）の示唆
前記２⑴ア(ア)ｂ(a)と同様の理由により，甲５の記載中の示唆に従
い，tacプロモーターの配列を導入することにより，コリネ型細菌の
ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域を「TATAAT」に改変して
本件発明１－２の構成とすることは，当業者が容易に想到し得たもの
である。
ｂ甲２，甲６及び甲８
前記２⑴ア(ア)ａ，ｂ⒝及び⒞と同様の理由により，コリネ型細菌
のＣＳ遺伝子の野生型プロモーターの－１０領域を「TATAAT」に変異
させて，本件発明１－２の構成とすることは，当業者が容易に想到し
得たものである。
ｃ本件発明１－２の効果
前記２⑴ア(ウ)と同様の理由により，本件審決が認定した相違点に
係る本件発明１－２の構成を採用することによる効果は，顕著なもの
とはいえない。
また，前記２⑵アのとおり，上記相違点に特段の技術的意義はなく，
ＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域に変異を導入して本件発明１
－２の構成とすることは，当業者が適宜変更できる事項に過ぎない。
イ被告の主張
(ア)甲５発明の認定及び本件発明１－２と甲５発明の対比について
前記⑴イのとおり，本件審決における甲５発明の認定に誤りはない。
そして，本件発明１－２と甲５発明とを対比すると，本件審決が認定
したとおりの一致点及び相違点が認められるものであって，本件審決の
認定に誤りはない。
(イ)相違点の容易想到性の判断について
前記２⑴イ(ア)と同様の理由により，本件審決が認定した相違点に係
る本件発明１－２の構成は，甲５と他の従来技術を組み合わせても，当
業者が容易に想到することができたものであるとはいえない。また，そ
の効果も従来予測し得なかった顕著なものである（前記２⑴イ(ウ)）。
したがって，これと同旨の本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張
の取消事由３－２は理由がない。
⑶取消事由３－３（本件発明１－３について）
ア原告らの主張
本件審決は，本件発明１－３について，本件発明１－１の認定判断を引
用するのみである。
したがって，前記⑴アと同様の理由により，本件審決は，違法なものと
して取り消されるべきである。
イ被告の主張
前記⑴イ及び⑵イのとおり，甲５発明及び甲５の記載中の示唆に基づい
て，又は甲５発明に甲２，甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発
明１－１及び本件発明１－２の構成を採用することは，当業者が容易に想
到し得たものであるとはいえないから，本件発明１－３についても，当業
者が容易に想到し得たものであるとはいえない。
したがって，この点に関する本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張
の取消事由３－３は理由がない。
４取消事由４（本件発明２及び４の進歩性，サポート要件及び実施可能要件の
判断の誤り）について
⑴原告らの主張
本件審決は，本件発明２は本件発明１－１と実質的に同一の発明であり，
本件発明４は本件発明１－１に更なる限定を加えた発明であるから，本件発
明１が，当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以
上，本件発明２及び本件発明４も，当業者が容易に発明をすることができた
ものであるとはいえない旨判断した。
しかしながら，取消事由２及び３に関する原告らの主張と同様の理由（前
記２及び３）により，本件発明２及び本件発明４についても，甲２を主引用
例として，又は甲５を主引用例として，当業者が容易に発明をすることがで
きたものである。また，本件発明２にサポート要件違反及び実施可能要件違
反があることは，前記１⑴ア及び⑶アのとおりであり，本件発明４にサポー
ト要件違反及び実施可能要件違反があることは，前記１⑶アのとおりである。
したがって，本件審決は，違法なものとして取り消されるべきである。
⑵被告の主張
取消事由１ないし３に関する被告の主張と同様の理由（前記１ないし３）
により，本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張の取消事由４は理由がな
い。
第４当裁判所の判断
１取消事由１（本件発明１のサポート要件及び実施可能要件の判断の誤り）に
ついて
⑴本件明細書の記載事項等について
ア本件発明１の特許請求の範囲（請求項１）の記載は，前記第２の２のと
おりである。
本件明細書（甲１）の発明の詳細な説明には，次のような記載がある（下
記記載中に引用する「表１，５ないし７，１０，１２，２３及び２６」に
ついては別紙１を参照）。
(ア)【技術分野】
【０００１】
本発明は，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築す
る方法及びその変異株を用いる発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法に
関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発酵法によるアミノ酸の生産に用いられる変異株の構築方法は，大別
すると２通りあり，１つは化学変異剤をもちいてDNAにランダムに変異
を導入する方法であり，もう１つは遺伝子組換えを用いる方法である。
遺伝子組換えを用いる方法では，目的物質の生合成に関与する代謝経路
上の遺伝子を強化したり，分解に関与する酵素の遺伝子を弱化したりす
ることにより，目的物質の生産性が向上した菌株を開発出来る。また，
その際に，目的遺伝子を強化する方法として，細胞内で，染色体とは独
立して自立複製可能なプラスミドが主に用いられてきた。
しかし，プラスミドを用いた目的遺伝子の強化方法には問題点がある。
具体的には目的遺伝子の強化の程度はプラスミド自体のコピー数によっ
て決まるため，目的遺伝子の種類によってはコピー数が高過ぎて，発現
量が高くなり過ぎることにより，生育が著しく抑制されたり，逆に目的
物質の生産能が低下したりする例が多くある。この様な場合，コピー数
が低い種類のプラスミドを用いることにより，目的遺伝子の強化の程度
を下げることが可能であるが，プラスミドの種類は多くの場合限定的で
あり，目的遺伝子の発現レベルを自由に調節することは不可能である。
【０００３】
もう一つの問題点は，プラスミドの複製が不安定であることがしばし
ばであり，プラスミドが脱落してしまうことである。…
(イ)【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は，プラスミドを用いることなく目的遺伝子の発現量の適度な
強化および調節を行うことができ，アミノ酸を高収率で生産する能力を
有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築する方法を提供するこ
とを目的とする。
本発明は，副生アスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起
こすことなく，コリネバクテリア菌株にグルタミン酸を高収率で生産す
る能力を付与することができるＧＤＨ用プロモーターを提供することを
目的とする。
本発明は，又，上記ＧＤＨ用プロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を
提供することを目的とする。
本発明は，又，上記遺伝子を有するＬ−グルタミン酸生産性コリネバク
テリア菌株を提供することを目的とする。
本発明は，構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸
の製造法を提供することを目的とする。
本発明は，コリネ型グルタミン酸生産菌を用いる，グルタミン酸の収
率を向上させ，より安価にグルタミン酸を製造するグルタミン酸発酵法
を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は，染色体上のアミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターを様々
に改変し，目的とする遺伝子の発現量を調節することにより上記課題を
効率的に解決できるとの知見に基づいてなされたものである。特に，プ
ロモーターの特異的領域である−３５領域および／または−１０領域に特
定の変異を導入することにより上記課題を効率的に解決できるとの知見
に基づいてなされたものである。
すなわち，本発明は，コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸又は核酸生
合成系遺伝子のプロモーター配列に，コンセンサス配列に近づくような
変異を起こさせるか又は遺伝子組換えにより導入して，コリネ型細菌の
変異体を調製し，該変異体を培養して目的とするアミノ酸又は核酸の産
生量の多い変異体を採取することを特徴とするアミノ酸又は核酸産生能
が向上したコリネ型細菌の調製方法を提供する。
【０００８】
本発明は，又，−３５領域にCGGTCA，TTGTCA，TTGACA及びTTGCCAか
らなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領
域にTATAAT配列若しくは該配列のATAATの塩基が別の塩基で置換され
ており，プロモーター機能を阻害しない配列を有することを特徴とする
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）産生遺伝子用プロモーターを
提供する。
本発明は，又，上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ産生遺伝子を提供する。
本発明は，又，上記遺伝子を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を
提供する。
【０００９】
本発明は，また，上記の方法で構築したアミノ酸又は核酸産生能が向
上したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地中に目的のアミノ酸又は核
酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法
による該アミノ酸又は核酸の製造方法を提供する。
本発明は，また，４−フルオログルタミン酸に対して耐性を有するコリ
ネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を，液体培地で培養し，培地中にＬ−グルタ
ミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造方法を提供する。
(ウ)【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明でいうコリネ型グルタミン酸生産菌とは，従来ブレビバクテリ
ウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合さ
れた細菌を含み(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，またコ
リネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
…
【００１２】
目的物質としてのアミノ酸としては，生合成に関与する遺伝子および
そのプロモーターが明らかになっているものであれば何でもよい。生合
成に関与する酵素の例として具体的には，グルタミン酸発酵の場合には，
ＧＤＨ，クエン酸合成酵素（ＣＳ），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉ
ＣＤＨ），ピルビン酸デヒドロゲナーセ（ＰＤＨ），アコニターゼ（Ａ
ＣＯ）等が有効である。
【００１５】
本発明では，コリネ型アミノ酸生産菌の染色体上の所望のアミノ酸生
合成系遺伝子のプロモーター配列，例えば，上記ＧＤＨ用プロモーター
などのプロモーター配列に，コンセンサス配列に近づくような変異を，
化学薬品などを用いる変異により起こさせるか又は該変異を遺伝子組換
えにより導入して，コリネ型アミノ酸生産菌の変異体を調製する。
ここで，コンセンサス配列は，多くのプロモーター配列を比較して最
も高頻度で出現する塩基を並べた配列である。このようなコンセンサス
配列としては，大腸菌，バチルスサブチリスなどのコンセンサス配列が
あげられる。…
上記変異は，１つのプロモーター配列，例えば，ＧＤＨ用プロモータ
ーのみに起こさせてもよいが，２つ以上のプロモーター配列，例えば，
ＧＤＨ用プロモーター，クエン酸合成酵素（ＣＳ）やイソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）に起こさせてもよい。
本発明では，このようにして得られた該変異体を培養して目的とする
アミノ酸の産生量の多い変異体を採取する。
【００１６】
グルタミン酸発酵の場合に，コリネ型グルタミン酸生産菌のＧＤＨは
それ自身のプロモーター配列をその上流域に持つことが明らかになって
いる（Sahmetal.MolecularMicrobiology(1992)，6，317-326）。
…ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列を，部位特異的変異法を用いて各
種変異を導入した配列に置換したものを多数作製し，それぞれの配列と
ＧＤＨ活性との関係を調べて，Ｌ−グルタミン酸生産性の高いものを選択
することができる。
【００１７】
本発明では，特に，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの−３５領域のＤＮＡ
配列がCGGTCA，TTGTCA，TTGACA及びTTGCCAからなる群から選ばれる少
なくとも一種のＤＮＡ配列となっているか，及び／又は該プロモーター
の−１０領域のＤＮＡ配列がTATAATとなっているか，若しくは−１０領
域にTATAAT配列のATAATの塩基が別の塩基で置換されており，プロモ
ーター機能を阻害しない配列となっているものが好ましい。…
ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列は，例えば，前出のSahmetal.
MolecularMicrobiology(1992)，6，317-326に記載されており，又，
配列番号１に記載されている。又，ＧＤＨ遺伝子自体の配列は，例えば，
同じくSahmetal.MolecularMicrobiology(1992)，6，317-326に
記載されており，又，配列番号１に記載されている。
同様にして，クエン酸合成酵素（ＣＳ）やイソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＩＣＤＨ）のプロモーターについても変異を起こさせることがで
きる。
このようにして，ＧＤＨ用プロモーターとしては，−３５領域に
CGGTCA，TTGTCA，TTGACA及びTTGCCAからなる群から選ばれる少なく
とも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列若しくは該配
列のATAATの塩基が別の塩基で置換されており，プロモーター機能を阻
害しない配列を有するものがあげられる。又，上記プロモーターを有す
るグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子を提供する。
【００１８】
ＣＳ用プロモーターとしては，−３５領域にTTGACA配列及び／又は−
１０領域にTATAAT配列を有しており，プロモーター機能を阻害しない
配列を有するものがあげられる。又，上記プロモーターを有するＣＳ遺
伝子を提供する。…
本発明は，又，上記遺伝子を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を
提供する。
【００２０】
コリネ型細菌は一般に，ビオチン制限下でＬ−グルタミン酸を生産する。
従って，培地中のビオチン量を制限するか，界面活性剤やペニシリンな
どのビオチン作用抑制物質を添加する。…
本発明によれば，コリネ型アミノ酸生産菌のアミノ酸生合成遺伝子の
プロモーター領域に変異を導入し，目的遺伝子の発現量を調節すること
により，目的アミノ酸を高収率で得ることができ，又プラスミドのよう
に脱落がなく，安定して目的アミノ酸を高収率で得ることができるので，
工業的に大きな利点がある。
【００２１】
また，本発明によれば，副生アスパラギン酸およびアラニンの増加を
引き起こすことなく，コリネバクテリア菌株にアミノ酸，特にグルタミ
ン酸を高収率で生産する能力を付与することができる各種プロモーター，
特にＧＤＨ用プロモーターを提供することができる。
また，本発明によれば，コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に変異処理を
施し，変異がＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に起こった，４−フルオロ
グルタミン酸に対して耐性を有する菌株を採取し，この菌株を培養する
ことによりグルタミン酸を高収率で得ることができるので，工業的に大
きな利点がある。
(エ)【００２２】
次に実施例により本発明を説明する。
実施例１：変異型ＧＤＨプロモーターの作製
部位特異変異法を用い：次の方法で変異型ＧＤＨプロモーターを調製
した。
（１）各種変異型のプロモーターを持つＧＤＨ遺伝子の作製
コリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの−３５領域および−１０
領域の野生型配列を配列１に示す。…
変異型プロモーターを持つＧＤＨ遺伝子を運ぶプラスミドの作製方法
は，以下の通りである。…コリネ型細菌野生株ATCC13869株の染色体遺
伝子を鋳型とし，ＧＤＨ遺伝子の上流と下流とでＰＣＲにより遺伝子を
増幅し，両端を平滑末端化した後に，それをプラスミドpHSG399（宝酒
造社製）のSmaI部位に挿入した。次にこのプラスミドのSalＩ部位に，
コリネ型細菌で複製可能な複製基点をもつプラスミドpSAK4から取得し
た複製起点を導入することによりプラスミドｐＧＤＨを作製した。この
方法において，ＧＤＨ遺伝子の上流側のプライマーとして配列表１から
６に示す配列を持つプライマーを用いることにより，上記のおのおのプ
ロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を作製することが出来る。…
【００２３】
（２）各プロモーター配列を有するＧＤＨの発現量の比較
上記の様にして作製したプラスミドをコリネ型細菌野生株ATCC13869
株にそれぞれ導入した。…作製したこれらの菌株のＧＤＨの発現量を比
較するために，ＧＤＨの比活性を調べた。…その結果を表１に示す。
【００２５】
上記ATCC13869／p6-2〜ATCC13869／p6-8は配列番号２〜６に対応
するものであり，これらの配列は配列番号１記載の配列（野生型）を基
に下線部を下記の通り変更したものである。
尚，これらの配列は，直鎖状，２本鎖の合成ＤＮＡである。
【００２６】
実施例２：変異株の取得
（１）４−フルオログルタミン酸に対する耐性を有する変異株の誘導
AJ13029株はWO96/06180に記載されるグルタミン酸生産株で，培養温
度が３1.５℃ではグルタミン酸を生産しないが，培養温度を３７℃にシ
フトするとビオチン作用抑制物質の非存在下でもグルタミン酸を生産す
る変異株である。本実施例では，ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムAJ13029株を変異株誘導の親株として用いた。もちろん，AJ13029
株以外のグルタミン酸生産株であっても４−フルオログルタミン酸に対
する耐性を有する変異株誘導の親株となりうる。
AJ13029株をCM2B寒天培地（…）上にて３1.５℃で２４時間培養して
菌体を得た。得られた菌体を２５０μg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンの水溶液で３０℃で３０分間処理した後，生存率
１％の当該菌体の懸濁液を４−フルオログルタミン酸（４ＦＧ）を含む寒
天平板培地（…）に播種し，３1.５℃で２０〜３０時間培養しコロニー
を形成させた。この際，初めに１mg/mlの４ＦＧを含む培地を傾斜をつ
けて作製し，その上に４ＦＧを含まない同培地を水平に重層した。これ
により，寒天培地表面は４ＦＧの濃度勾配が作製される。このプレート
上に上記変異処理菌体を播種すると，菌株の生育限界の領域を境に境界
線が出来る。この境界よりも高濃度の４ＦＧが存在する領域でコロニー
を形成した株を採種した。かくして約１０，０００個の変異処理菌株か
ら約５０株の４ＦＧ耐性株を取得した。
【００２９】
（２）４ＦＧに対して耐性を示す変異株によるＬ−グルタミン酸の生産能
の確認
上記(1)において得られた約５０株の変異株及びその親株である
AJ13029株について，グルタミン酸の生産能を以下のようにして確認し
た。…この約５０株を培養しグルタミン酸収率が親株より高く，ＧＤＨ
活性も高い株を２株分離した（…）。それぞれのＧＤＨ活性を測定した
ところ両株ともＧＤＨの比活性が上昇していた（表５）。…そこでＧＤ
Ｈ遺伝子の塩基配列を解析したところＧＤＨのプロモーター領域内にの
み変異点が存在していた（表６）。
【００３３】
実施例３コリネ型グルタミン酸生産菌のＣＳ遺伝子プロモーター領域
への変異の導入
本実施例ではグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびクエン
酸合成酵素（ＣＳ）をコードする遺伝子のプロモーター強化株を作成し
た例を示す。
（１）gltA遺伝子のクローニング
コリネ型細菌のクエン酸合成酵素をコードする遺伝子gltAの塩基配
列は既に明らかにされている（Microbiol.1401817-1828(1994)）。…
【００３４】
（２）gltAプロモーターへの変異導入
gltAプロモーター領域への変異導入には宝酒造社製のMutan-Super
ExpressKmを用いた。…
【００３５】
…gltAプロモーター領域が表７に示す配列に置換されたものを，それ
ぞれpKF19CS1，pKF19CS2，pKF19CS4と名づけた。
【００４３】
（７）gltAプロモーター置換株の取得
相同組換えにより，変異型gltA遺伝子を組み込んだBLCS11，BLCS12，
BLCS14株より，まず，カナマイシン感受性株を取得した。…
カナマイシン感受性になった株から，染色体を抽出し，配列番号７お
よび配列番号８に示すプライマーを用いてPCRを行ないgltA遺伝子断
片を調製した。得られた増幅断片は宝酒造社製のSUPREC02にて精製し
た後，配列番号１３に示すプライマーを用いてシーケンス反応を行ない，
そのプロモーター領域の配列を決定した。その結果，表７中のpKF19CS1
と同じプロモーター配列をもつ株をGB01，pKF19CS2と同じプロモータ
ー配列をもつ株をGB02，pKF19CS4と同じプロモーター配列をもつ株を
GB03と名づけた。…
【００４４】
（８）gltAプロモーター変異株のクエン酸合成酵素活性測定
（７）で得られたFGR2，GB01，GB02，GB03株及びFGR2/pSFKC株を…
クエン酸合成酵素の活性を測定した。測定結果を表１０に示す。gltAプ
ロモーター置換株はその親株に比しクエン酸合成酵素活性が上昇してい
ることが確認された。
【００４６】
（９）gltAプロモーター置換株の培養成績
…表１２に示すようにGB01やFGR2/pSFKC株よりは，むしろGB02や
GB02株（判決注：GB03株の誤記と認められる。）ではＬ－グルタミン酸
の大幅な収率向上が認められた。以上のことより，これらの株のグルタ
ミン酸収率向上において，プロモーターに変異を導入しCS活性を２〜
４倍に強めることで好成績となりうることが示された。
【００８７】
実施例７：コリネ型グルタミン酸生産菌のGDH遺伝子プロモーター領域
への変異の導入
（１）変異型gdhプラスミドの構築
上記実施例２に示したFGR1株およびFGR2株がもつGDHプロモーター
配列を有するプラスミドを部位特異的変異手法により構築した。FGR1株
のGDHプロモーター配列を得るためには，…をプライマーとして用い
ATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行なった。さらにこのPCR
産物を混合したものを鋳型として…PCRを行なった。こうして得られた
PCR産物をpSFKT2（特願平11−69896）のSmal部位に挿入したpSFKTG11
を構築した。FGR2株のGDHプロモーター配列を得るためには，…をプラ
イマーとして用いATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行なっ
た。さらにこのPCR産物を混合したものを鋳型として…PCRを行なった。
こうして得られたPCR産物をpSFKT2（特願平11−69896）のSmal部位に
挿入したpSFKTG07を構築した。なお，pSFKTG11およびpSFKTG07のSmal
部位に挿入したDNA断片の塩基配列決定を行ない，GDHのプロモーター
領域以外に変異が導入されていないことを確認している。
【００８８】
（２）gdhプロモーター変異株の構築
次にpSFKTG11およびpSFKTG07を電気パルス法によりAJ13029株に導
入し，25℃で25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレート上に生育す
る形質転換体を選択した。この形質転換体を34℃で培養し，34℃でカナ
マイシン耐性を示す株を選択した。34℃でカナマイシン耐性を示すこと
はpSFKTG11あるいはpSFKTG07がAJ13029株の染色体上に組み込まれた
ことを意味する。このような染色体上にプラスミドが組み込まれた株よ
りカナマイシン感受性株を取得した。これらの株のGDHプロモーター配
列を決定し，pSFKTG11およびpSFKTG07と同じgdhプロモーター配列を
持つ株をそれぞれGA01，GA02とした。
（３）gdhプロモーター変異株のＬ－グルタミン酸生産能の確認
GA01株，GA02株およびその親株AJ13029株についてグルタミン酸の
生産能を上記実施例２（２）と同じ方法で確認した。その結果，GA01お
よびGA02では顕著なグルタミン酸の蓄積向上が認められた（表２３）。
イ前記アの記載事項によれば，本件明細書の発明の詳細な説明には，本件
発明１に関し，次のような開示があることが認められる。
(ア)発酵法によるアミノ酸の生産に用いられる変異株の構築方法とし
て遺伝子組換えを用いる場合，目的遺伝子を強化するために，細胞内で
染色体とは独立して自律複製が可能なプラスミドが主に用いられてきた
が，目的遺伝子の強化の程度はプラスミド自体のコピー数によって決ま
るため，目的遺伝子の種類によっては，コピー数が高過ぎて生育が著し
く抑制されたり，逆に目的物質の生産能が低下したりする例が多くあり，
また，プラスミドの複製は，しばしば不安定であり，プラスミドが脱落
してしまうという問題がある（【０００２】）。
(イ)「本発明」は，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うこ
とができ，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を，プラス
ミドを用いることなく，遺伝子組換え又は変異によって構築する方法の
提供を目的とする（【０００６】）。
そして，「本発明」は，上記課題を解決するために，コリネ型細菌の
染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に，コ
ンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか，又は遺伝子組換え
により変異を導入して，コリネ型細菌の変異体を調製し，該変異体を培
養して，目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取する
という構成を採用した（【０００７】）。
(ウ)アミノ酸の生合成に関与する酵素の例として，グルタミン酸発酵の
場合には，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ），クエン酸合成酵
素（ＣＳ）等が有効である（【００１２】）。また，上記の変異は，１
つの遺伝子のプロモーター配列のみに起こさせてもよいし，２つ以上の
プロモーター配列に起こさせてもよい（【００１５】）。
「本発明」では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域のＤＮＡ
配列が，TTGTCA等からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列
となっているか，及び／又は該プロモーターの−１０領域のＤＮＡ配列が
TATAAT等となっているものが好ましい（【００１７】）。
また，ＣＳ遺伝子のプロモーターについては，−３５領域にTTGACA配
列及び／又は−１０領域にTATAAT配列を有するものが挙げられる（【０
０１８】）。
「本発明」は，コリネ型アミノ酸生産菌のアミノ酸生合成遺伝子のプ
ロモーター領域に変異を導入し，目的遺伝子の発現量を調節することに
より，目的アミノ酸を高収率で得ることができ，又プラスミドのように
脱落がなく，安定して目的アミノ酸を高収率で得ることができるので，
工業的に大きな利点がある（【００２０】）。
また，「本発明」によれば，副生アスパラギン酸及びアラニンの増加
を引き起こすことなく，コリネバクテリア菌株にアミノ酸，特にグルタ
ミン酸を高収率で生産する能力を付与できる（【００２１】）。
(エ)ａ「本発明」の実施例１である「ATCC13869/p6-8」は，コリネ型細
菌野生株(ATCC13869)に，プロモーター配列の－３５領域（TGGTCA配
列）がTTGTCA配列に改変され，かつ，同－１０領域（CATAAT配列）
がTATAAT配列に改変されたＧＤＨ遺伝子のプラスミドを導入したも
のである。また，「ATCC13869/p6-8」のＧＤＨ比活性（401.3）は，
親株（ATCC13869）の約４９倍であることが示されている。（【００２
２】，【００２３】，【００２５】，表１）。
ｂ「本発明」の実施例２である「FGR2」は，ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム（AJ13029）を変異処理したものであって，AJ13029
のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域（TGGTCA配列）に
TTGTCA配列への変異を有し，かつ，同－１０領域（CATAAT配列）に
TATAAT配列への変異を有するものである。また，FGR2のＧＤＨ比活性
は，親株（AJ13029）の約３．４倍であり，Ｌ－グルタミン酸生成（3.0
g/dl）は，AJ13029（2.6g/dl）より増大したことが示されている。（【０
０２６】，【００２９】，表５，６）。
ｃ「本発明」の実施例３である「GBO2」及び「GB03」は，いずれも，
FGR2（前記ｂ）のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域（TATAGC
配列）を改変して，TATAAT配列を導入したものであり，「GB03」は，
さらに，同－３５領域（ATGGCT配列）を改変して，TTGACA配列を導入
したものである。なお，GBO2及びGB03のＧＤＨ遺伝子のプロモータ
ー配列の－３５領域及び－１０領域は，FGR2と同一である。
また，①GBO2のクエン酸合成酵素の比活性は，FGR2の約１．９倍で
あり，GBO3のクエン酸合成酵素の比活性は，同約４．０倍であること，
②GBO2及びGBO3のＬ－グルタミン酸生成（各9.4g/l）は，FGR2（8.9
g/l）より増大したことが示されている。
（以上につき，【００３３】～【００３５】，【００４３】，表７，
１０，１２）。
ｄ「本発明」の実施例７である「GA02」は，FGR2（前記ｂ）が持つＧ
ＤＨ遺伝子のプロモーター配列を用いて，AJ13029（前記ａ）の染色体
上に変異を導入したものであって，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列
の－３５領域及び－１０領域は，FGR2と同一である。また，GAO2のＧ
ＤＨ比活性は，親株（AJ13029）の約３．５倍であること，GAO2のＬ－
グルタミン酸生成（2.9g/dl）は，AJ13029（2.6g/dl）より増大し
たことが示されている。（【００８７】，【００８８】，表１０，２
３）。
⑵取消事由１－１（ＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入の実施可能性
について）
ア前記⑴イのとおり，本件明細書の発明の詳細な説明には，①「本発明」
の課題は，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，
アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を，プラスミドを用いる
ことなく，遺伝子組換え又は変異によって構築する方法を提供することで
ある旨，②「本発明」は，上記①の課題を解決するために，コリネ型細菌
の染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に，コ
ンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか，又は遺伝子組換えに
より変異を導入して，コリネ型細菌の変異体を調製し，該変異体を培養し
て，目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取するという
構成を採用したものであり，また，上記の変異は，１つの遺伝子のプロモ
ーター配列のみに起こしてもよいし，２つ以上の遺伝子のプロモーター配
列に起こしてもよい旨，③かかる変異の構成として，ＧＤＨ遺伝子のプロ
モーター配列の－３５領域がTTGTCAであって，かつ，同－１０領域が
TATAATとなっているものが好ましい旨，④実施例２の「FGR2」は，親株
（AJ13029）のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領
域に本件発明１－１の配列への変異を有するものであって，そのＧＤＨ活
性比は親株の３．４倍であり，Ｌ－グルタミン酸生産能も親株より増大し
た旨が記載されている。
かかる記載を総合すると，本件明細書に接した当業者は，本件発明１－
１の構成を有するＬ－グルタミン酸の製造方法，すなわち，コリネ型細菌
の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にTTGTCA配
列を導入し，かつ，同－１０領域にTATAAT配列を導入する方法によって，
目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，アミノ酸を
高収率で生産する能力を有する変異株を，プラスミドを用いることなく，
遺伝子組換え又は変異によって構築する方法を提供するという課題を解
決できることを認識できるものと認められる。
また，同様の理由により，本件明細書の発明の詳細な説明は，当業者が
本件発明１（本件発明１－１）の実施をすることができる程度に明確かつ
十分に記載されているといえる。
イこれに対し原告らは，原告らの実験（甲４９）によれば，本件明細書に
記載された実施例の親株（AJ13029）と異なるコリネ型細菌の菌株
（ATCC13869）を親株として，親株のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に本
件発明１－１と同じ変異を導入した菌株のＬ－グルタミン酸生産量が，親
株より低下したことが認められるから，グルタミン酸の収率を向上させる
という発明の課題は，本件発明１－１の態様全体にわたって解決できるも
のではなく，また，本件明細書の発明の詳細な説明は，グルタミン酸の収
率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されていない旨主張する。
しかしながら，証拠（乙１０（実施例２，表６及び７），乙１６（１頁
左下欄末行～右下欄５行，２頁右上欄９行等））によれば，コリネ型細菌
がグルタミン酸を生産する条件（培養・誘導条件）は，菌株によって異な
るものであり，例えば，AJ13029は，培養温度を最適生育温度から上昇さ
せることによって，グルタミン酸生産が誘導されるものである一方，
ATCC13869は，界面活性剤の添加によって，グルタミン酸生産が誘導され
るものであることが，本件出願当時から公知であったことが認められる。
一方，甲４９の実験では，ATCC13869を親株とする変異導入株のグルタ
ミン酸産生を誘導するに当たり，界面活性剤を添加する方法ではなく，３
１．５℃で培養を開始し，８時間後に３７℃にシフトさせる方法を用いて
いる。
そうすると，甲４９の実験において，ATCC13869を親株とする変異導入
株に採用されている培養・誘導条件は，当業者が通常採用しないものであ
るといえる。そして，被告の実験報告書（乙１４）によれば，ATCC13869を
親株とする変異導入株のグルタミン酸産生を誘導するに当たり，界面活性
剤を添加する方法を用いたところ，本件明細書に記載された実施例
（AJ13029を親株に用いたもの）と同程度の，グルタミン酸生産能の増大
が確認されたことが認められる。
以上によれば，本件明細書に接した当業者が，本件発明１－１の構成を
有するＬ－グルタミン酸の製造方法によって，発明の課題を解決できるこ
とを認識できるものと認められる旨の前記アの判断は，甲４９の実験結果
をもって，左右されるものではない。
したがって，原告らの上記主張は採用することができない。
⑶取消事由１－２（ＣＳ遺伝子のプロモーターへの変異導入の実施可能性に
ついて）
ア本件明細書の記載事項
前記⑴イ及び(2)アのとおり，本件明細書には，①「本発明」の課題は，
アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を，遺伝子組換え又は変
異によって構築する方法を提供することであり，そのために，コリネ型細
菌の染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に，
コンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか，又は遺伝子組換え
により変異を導入して，コリネ型細菌の変異体を調製し，該変異体を培養
して，目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取するとい
う構成を採用したものである旨，②かかる構成として，ＣＳ遺伝子のプロ
モーター配列の－１０領域がTATAATであるものなどが挙げられる旨，③
実施例２の「FGR2」は，親株（AJ13029）のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配
列の－３５領域及び－１０領域に本件発明１－１の配列への変異を有す
るものであって，そのＧＤＨ活性比は親株の３．４倍であり，Ｌ－グルタ
ミン酸生産能は親株より増大した旨，④実施例３の「GBO2」及び「GB03」
は，FGR2のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域を改変して，本件
発明１－２の配列を導入したものであって，そのクエン酸合成酵素比活性
は，GB02がFGR2の約１．９倍，GBO3が同約４．０倍であり，いずれも，
Ｌ－グルタミン酸生産能はFGR2より増大した旨が記載されている。
イＬ－グルタミン酸の生成過程に関する技術常識
(ア)甲１３（岩波生物学辞典第４版平成８年７月１２日発行）によれ
ば，本件出願時において，Ｌ－グルタミン酸の生合成に関し，以下のよ
うな技術常識が存在したものと認められる。
ａ別紙２のとおり，解糖及びその他の異化作用によって生じたアセチ
ルＣｏＡを完全に水と二酸化炭素に分解する酸化的過程であるクエン
酸回路（ＴＣＡ回路）は，８段階からなり，アセチルＣｏＡが，オキ
サロ酢酸と縮合してクエン酸になり，この後，イソクエン酸，α－ケ
トグルタル酸，スクシニルＣｏＡ，コハク酸，フマル酸，Ｌ－リンゴ
酸，オキサロ酢酸に順次変換され，再びクエン酸が生成するサイクル
が繰り返される。
ｂＴＣＡ回路においては，前記ａのそれぞれの酸への変換を行う８つ
の酵素が存在する。また，この回路の回転の強さ（速度）は，その含
まれる物質の量に依存する。
ｃＬ－グルタミン酸は，ＴＣＡ回路の中間生成物であるα－ケトグル
タル酸から生成する。
ｄクエン酸生成酵素（ＣＳ）は，ＴＣＡ回路において，オキサロ酢酸
とアセチルＣｏＡとを縮合して，クエン酸を合成する反応を触媒する
酵素であって，ＣＳの活性が増加すると，クエン酸の合成反応が促進
される。
ｅα－ケトグルタル酸をＬ－グルタミン酸に変換するＧＤＨは，アン
モニアをα－ケトグルタル酸に還元的に固定し，Ｌ－グルタミン酸を
生成する反応を促進する酵素である。
(イ)前記(ア)の技術常識に鑑みると，ＴＣＡ回路において，ＣＳの活性
が増加すると，クエン酸の合成反応が促進され，クエン酸の生成が増加
するのに伴い，クエン酸から生じるイソクエン酸の生成が増加し，それ
に伴い，イソクエン酸から生じるα－ケトグルタル酸の生成が増加する
ことになるため，α－ケトグルタル酸をＬ－グルタミン酸に変換するＧ
ＤＨが増加しなくとも，Ｌ－グルタミン酸の生成が増加するであろうこ
とは，本件出願時において，当業者が予測できたものといえる。
ウ当業者の理解
前記アの本件明細書の記載及び前記イの本件出願当時の技術常識に鑑み
ると，本件明細書に接した当業者は，本件発明１－２の構成を有するＬ－
グルタミン酸の製造方法，すなわち，コリネ型細菌の染色体上にあるＣＳ
遺伝子のプロモーター配列の－１０領域を改変してTATAAT配列を導入す
る方法によって，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことが
でき，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を，プラスミドを
用いることなく，遺伝子組換え又は変異によって構築する方法を提供する
という課題を解決できることを認識できるものと認められる。
また，同様の理由により，本件明細書の発明の詳細な説明は，当業者が
本件発明１（本件発明１－２）の実施をすることができる程度に明確かつ
十分に記載されているといえる。
エ原告らの主張について
これに対し原告らは，ＴＣＡ回路のような一連の反応における全体の反
応速度は，最も遅い反応と実質上等しくなるため（律速段階。甲６６～６
８），ＣＳの発現のみを強化してクエン酸の生成を促進しても，後続の反
応のいずれかの速度が遅い場合には，Ｌ－グルタミン酸の生成速度は増加
しないものであって，ＣＳの発現のみを増強してもＬ－グルタミン酸の生
産量が増加しないことは，甲４及び甲３４にも明示されている旨主張する。
そこで，かかる主張の当否について検討する。
(ア)律速段階について
ａ各文献の記載
(a)甲６６（化学大辞典平成元年１０月２０日発行）には，次のよ
うな記載がある。
「化学反応が，複数の素反応が順に進行することにより成り立っ
ている時（複合反応），ある素反応の速度が他のすべての素反応の
速度よりも格段に遅ければ，全体としての反応速度はこの素反応の
速度と実質上等しくなる。」
⒝甲６７（岩波理化学辞典第５版平成１０年２月２０日発行）に
は，次のような記載がある。
「律速段階…
化学反応などの動的過程がいくつかの段階によって構成されてい
るとき，そのうちの１つがほかの段階にくらべて非常に緩慢に進行
するために，それによって全過程の進行が実際上支配されてしまう
ような段階をいう。」
⒞甲６８（P.W.ATKINS物理化学（下）第２版昭和６０年１月１
０日発行）には，次のような記載がある。
「逐次反応と定常状態
ある種の反応は，つぎの二つの連続一次反応のように中間体の形
成を経て進行する。
…［Ｂ］０＝０なる条件を課すと，次式が得られる。
…［Ｃ］ｔは［Ａ］と［Ｂ］に対する解から直接得られる。
…上の計算から“律速段階”の意味が明らかになる。まず，速度
定数ｋ’１がｋ１よりずっと大きいとすると，Ｂ分子ができると，こ
れはすぐに崩壊してＣになってしまう。よって，生成物Ｃのできる
速度はほぼ完全に中間体Ｂが形成される速度によって決まる。この
ことはｋ’１≫ｋ１の場合について(27･3･7c)式を調べてみれば確認
できる。この条件のもとではｅｘｐ（－ｋ’１ｔ）は，ｅｘｐ（－ｋ
１ｔ）よりずっと小さいので無視できてつぎのようになる。
ただし，分母のｋ１がｋ’１に比べて小さいとして無視した。この
式から，予期した通りＣの生成の仕方が小さい方の速度定数にだけ
依存することがわかる。このようなわけで，もっとも小さい速度定
数をもつ段階を反応の律速段階という。
Ｂの生成速度がＣへの崩壊速度よりずっと速いなら律速段階はＢ
の生成物への崩壊である。ｋ’１≪ｋ１として上で行ったのと同じ議
論から次式が得られる。
この場合にもやはり予測通りに全反応の速度は遅い方の，律速段
階に対する速度定数により支配される。この過程，すなわち速い段
階に遅い段階がつづく過程は１車線の橋しかないところに６車線
の高速道路を接続したものに似ている。この場合の交通の流れは橋
を渡る速度で決まる。」
ｂ前記ａの記載事項によれば，律速段階とは，他の段階の反応と比べ
て格段に遅い反応をいうものであり，律速段階が存在する場合には，
その他の段階の反応速度を上げても，全反応の速度は上がらないこと
を理解できる。
一方，本件証拠上，ＴＣＡ回路中のコリネ型細菌のグルタミン酸の
生合成系路における，各段階の反応速度は明らかにされておらず，Ｃ
Ｓによるクエン酸の生成反応の後続の反応に，律速段階すなわち，他
の段階の反応と比べて格段に遅い反応が存在することを認めるに足り
る証拠はない。
(イ)甲４及び甲３４について
ａ甲４には，次のような記載がある。
「我々は，制御，クエン酸合成酵素遺伝子（gltA）の単離，その核
酸配列，同種及び異種発現，並びにその転写機構との関連で，C.グル
タミカムのクエン酸合成酵素を記載する。」（１８１８頁左欄３６行
～４０行）
「C.グルタミカムを過剰発現するgltA株は，試験したすべての培
地（例えば，LB培地では80分ではなく120分の倍増時間）で生育が
悪くなったことを示し，ＣＳのレベルの上昇による細胞の軽度な障害
を示したことは注目に値する。」（１８２０頁右欄３２行～３６行）
「ＣＳ酵素活性の上昇がグルタミン酸分泌に及ぼす影響を試験する
ために，標準的なグルタミン酸醗酵…をC.グルタミカムWTとWT（pJC-
gltA3A）で行った。これらの実験では，両方の菌株で，約17μmolmin-
（ｇ乾燥重量）-1
の同じグルタミン酸分泌速度が認められた。したが
って，C.グルタミカムのグルタミン酸を分泌する能力は，単にＣＳ酵
素レベルを上昇させるのみでは，促進することはできない。この知見
は，C.グルタミカムのＣＳ酵素は非常に活性が高く，恒常的に形成さ
れ，弱い調節しか受けない（前述）という観察と合わせて，（i）染色
体にコードされたＣＳ酵素活性は，この生物のグルタミン酸生産に十
分であり，（ii）ＣＳ酵素以外の因子がクエン酸サイクルへの炭素流
入速度を制限していることを示している。」（１８２１頁左欄１７行
～右欄５行）
ｂ甲３４には，次のような記載がある（下記記載中に引用する「第２
表，第１０表，第１１表及び第１３表」については別紙３を参照）。
(a)「Ｌ－グルタミン酸は調味料として幅広い用途があり，グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌を培養して該細菌にＬ－グルタミン酸を
生産せしめ，生成するＬ－グルタミン酸を該細菌の培養物から分離
する発酵法により工業的に生産されている。」（２頁左下欄１０行
～１４行）
「…グルタミン酸生合成に関与する酵素の活性を強化すること
によりＬ－グルタミン酸の生産速度を高めるとともに効率良くＬ
－グルタミン酸を生成させる試みも近年行われるようになり，この
目的を達成するためにグルタミン酸の生合成経路に関与する各種
酵素遺伝子のクローニングが行われつつある。」（２頁右下欄１３
行～１９行）
⒝「しかしながら，Ｌ－グルタミン酸発酵においてその生産性を十
分向上することのできる菌株については，これまでに報告された例
がなかった。
（問題点を解決するための手段および作用）
本発明者らは上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果，グル
タミン酸生合成経路に関与する酵素遺伝子のうち，少なくとも２種
以上の酵素遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いることにより同時に
強化した種々の菌株を作製することに成功し，これらの菌株を用い
てグルタミン酸発酵を行ったところ，少なくともグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（…ＧＤＨ）遺伝子とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（…ＩＣＤＨ）遺伝子を含む少なくとも２種以上のグルタミン酸生
合成経路に関与するグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来の酵素
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換された菌株を用いてグル
タミン酸発酵を行なった場合には親株を使用した場合に比較して
培地中へのＬ－グルタミン酸の蓄積レベルのみならず対糖収率も
著しく向上していることを見出し，本発明を完成するに到った。」
（３頁右上欄５行～左下欄６行）
⒞「多重強化株を作製する際の材料となる組換えプラスミドとして，
ＧＤＨ遺伝子を含むpAG1001，ＩＣＤＨ遺伝子を含むpAG3001，ＡＨ
遺伝子を含むpAG5001，およびＣＳ遺伝子を含むpAG4003等が挙げ
られる。」（６頁右下欄８行～１２行）
「本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌が保有する組換え体
ＤＮＡの例としては，後述のプラスミドpIG101，pAIG321，pCIG231，
pCAIG4等が挙げられる。pIGl01はpAG50にグルタミン酸生産性コ
リネ型細菌由来のＧＤＨ遺伝子とＩＣＤＨ遺伝子が同時に組込まれ
たものである。pAIG321は同時にＡＨ遺伝子，ＩＣＤＨ遺伝子およ
びＧＤＨ遺伝子が同時に組込まれたものである。また，pCIG231は
同時にＣＳ，ＩＣＤＨ，ＧＤＨの３種の酵素の遺伝子がpAG50に同
時に組込まれたものである。さらにpCAIG4はpAG50にＣＳ，ＡＨ，
ＩＣＤＨ，およびＧＤＨの４種の酵素の遺伝子が同時に組込まれた
ものである。」（７頁左上欄７行～１９行）
「（実施例）
実施例１
本実施例では，グルタミン酸生産性コリネ型細菌で，ＧＤＨとＩ
ＣＤＨの活性が同時に強化された２重強化株を作製した例を示す。
ＧＤＨ遺伝子およびＩＣＤＨ遺伝子を含む組換えプラスミドとし
てそれぞれpAG1001およびpAG3001を使用した。」（８頁右上欄１
行～８行）
「ＧＤＨ活性は，…で測定することにより求めた。…結果を第２
表に示す。」（１７頁左上欄１１行～１８行）
⒟「実施例３
実施例では，ＣＳ＋ＩＣＤＨ＋ＧＤＨの３重強化株を作成した例
を示す。またＣＳ＋ＩＣＤＨの２重強化株およびＣＳ＋ＧＤＨの２
重強化株を作成した例についても同時に示す。
組換えプラスミドを作製する際の材料としては前述のpAG1001，
pAG3001の他にＣＳ遺伝子を含む組換えプラスミドpAG4003を用い
た。」（３５頁左下欄１行～８行）
「（６）プラスミドpAG4001保有菌株のＣＳ活性の測定」
…第１０表に示した様に，プラスミドpAG4001保持菌株は，ベク
ターpAG50保持菌株やプラスミド非保持菌に比べて，高いＣＳ比活
性を示した。」（４１頁左上欄７行～右上欄４行）
「pCI31およびpCG5はそれぞれＣＳとＩＣＤＨを同時に含む組換
えプラスミドおよびＣＳとＧＤＨを同時に含む組換えプラスミド
である。」（４２頁右下欄１２行～１４行）
「pCI31，pCG5，およびpCIG231の各プラスミドを保持する宿主菌
（Corynebacteriummelassecola801）よりそれぞれ細胞抽出液を調
製し，ＣＳ，ＩＣＤＨ，ＧＤＨの酵素活性をプラスミドを保持しな
い宿主菌の細胞抽出液を用いた場合と比較した。
…第１１表の結果によりpCI31保持株，pCG5保持株，pCIG231保
持株はそれぞれ目的の酵素活性が全て強化されていることが確認
された。」（４３頁左上欄９行～右上欄５行）
(e)「実施例５
本実施例では，実施例１～４で得られた多重強化株を用いたグル
タミン酸発酵の例を示す。
…得られた結果を第１３表に示す。
…第１３表から明らかなように，少なくともＧＤＨとＩＣＤＨの
両酵素が同時に強化された菌株では，他の菌株に比較してグルタミ
ン酸蓄積量，対糖収率ともに高い成績を示した。」（４４頁左上欄
７行～４５頁左上欄４行）
ｃ甲４及び甲３４に開示された事項
前記ａ及びｂの記載事項によれば，甲４及び甲３４には，ＣＳ遺伝
子のみを増強しても，グルタミン酸の生産が増加しなかったことが開
示されていると見られなくもない。
しかしながら，甲４は，C.グルタミカムというコリネ型細菌の一種
について，ＣＳ酵素の活性がもともと非常に高かったために，遺伝子
操作によるＣＳ酵素レベルの上昇が効果を発揮しなかったことを述
べているのにとどまるから，律速段階の存在を裏付けるに足りるもの
ではないし，そもそも，一細菌に関するものにすぎない甲４の結論を
一般化できるかどうかにも疑問がある。また，甲３４は，ＧＤＨとＩ
ＣＤＨの両酵素が同時に強化された菌株では，グルタミン酸蓄積量，
対糖収率ともに高い成績を示したと述べているのみで，ＣＳ酵素が強
化された菌株については，何らの結論を述べるものではない上，その
記述を詳細に検討すると，ＧＤＨ遺伝子，ＩＣＤＨ遺伝子，ＡＨ遺伝
子を同時に組み込んだ細菌（pAIG321）よりも，上記３遺伝子に加え，
ＣＳ遺伝子を組み込んだ細菌（pCAIG4）の方が，グルタミン酸濃度，
対糖収率ともに高くなっている（第１３表参照）というように，ＣＳ
遺伝子を組み込むことにより効果が発揮されているように見える実
験結果も紹介されている。これらのことを考慮すると，上記各書証の
記載は，いずれも，ＴＣＡ回路中のコリネ型細菌のグルタミン酸の生
合成系路における，ＣＳによるクエン酸の生成反応の後続の反応に，
律速段階が存在することを裏付けるものであるとはいえない。
(ウ)小括
以上によれば，原告らの上記主張は，その前提を欠くものであって，
採用することはできない。
⑷取消事由１－３（プロモーター－３５領域及び－１０領域の周辺領域につ
いて）
ア前記⑵ア及び⑶ウのとおり，本件明細書の発明の詳細な説明は，当業者
が本件発明１（本件発明１－１ないし１－３）の実施をすることができる
程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
イこれに対し原告らは，本件明細書の実施例及びその他の記載並びに技術
常識を参照しても，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプロモーターの－３５
領域と－１０領域の間の配列，－３５領域の上流領域及び－１０領域の下
流領域を任意の配列や長さにした場合に，Ｌ－グルタミン酸の生産性が向
上することを当業者は認識することができないから，本件発明１はサポー
ト要件に適合するものとはいえず，同様の理由により，本件明細書の発明
の詳細な説明は実施可能要件に適合するものとはいえない旨主張する。そ
こで，かかる主張の当否について検討する。
(ア)前記⑴イ(エ)ａのとおり，「本発明」の実施例１である「ATCC13869
/p6-8」は，コリネ型細菌野生株（ATCC13869）に，プロモーター配列の
－３５領域及び－１０領域を改変して，本件発明１－１の配列としたＧ
ＤＨ遺伝子を組み込んだプラスミドを導入したものである。そして，本
件明細書には，「ATCC13869/p6-8」のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列
の－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列は，親株（ATCC13869）と
同一であることが示されている（【００２５】）。
また，前記⑴イ(エ)ｂのとおり，実施例２の「FGR2」は，親株（AJ13029）
のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域に本件
発明１－１の配列への変異を有するものである。そして，本件明細書に
は，「FGR2」のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域と－１０
領域の間の領域の配列は，１塩基の欠失があるほかは，親株（ATCC13869）
と同一であることが示されている（表６）。
さらに，「本発明」の実施例３である「GB02」及び「GB03」は，FGR2
のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域を改変して，本件発明１
－２の配列を導入したものであり，「GB03」は，さらに，同－３５領域
を改変して，本件発明４の配列を導入したものである。そして，本件明
細書には，GBO2及びGB03の作製に当たり，FGR2のＣＳ遺伝子のプロモ
ーター配列の－３５領域と－１０領域の間の領域に変異を加えた旨の記
載はないことから（【００３３】～【００４７】），－３５領域と－１
０領域の周辺領域は，１塩基の欠失があるほかは，親株（AJ13029）と同
じ配列を有していることを理解できる。
加えて，前記⑴イ(エ)ｄのとおり，「本発明」の実施例７である「GAO2」
は，FGR2が持つＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列を用いて，AJ13029の
染色体上に変異を導入したものであって，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター
配列の－３５領域及び－１０領域はFGR2と同一である。そして，本件明
細書には，GAO2及びGAO3は，ＧＤＨのプロモーター領域以外に変異が
導入されていないことを確認した上で，AJ13029に変異が導入されて，
作製されたものであることが記載されている（【００８７】～【００９
３】）。
(イ)以上によれば，遺伝子のプロモーターの－３５領域及び－１０領域
の周辺領域の配列や長さがプロモーター活性に影響を与えることが，仮
に公知であったとしても，本件明細書に接した当業者は，ＧＤＨ遺伝子
のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域と，ＣＳ遺伝子の－１
０領域を特定の配列とする変異を染色体上に導入することを解決手段と
する本件発明１において，プロモーター配列の－３５領域と－１０領域
の周辺領域については，野生株と同様でよいことを理解できるのである
から，本件発明１の構成を有するＬ－グルタミン酸の製造方法によって，
発明の課題（前記⑵ア）を解決できることを認識できるものといえる。
また，同様の理由により，当業者は，本件明細書の記載から，ＧＤＨ
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域と，ＣＳ遺伝子
のプロモーター配列の－１０領域の周辺領域は野生株と同様でよいこと
を前提にして本件発明１の実施をすることができるといえる。
したがって，原告らの上記主張は採用することができない。
⑸小括
前記⑴ないし⑷のとおり，特許請求の範囲の請求項１の記載は，サポート
要件に適合するものと認められ，また，本件明細書の発明の詳細な説明の記
載は，実施可能要件に適合するものと認められる。
したがって，これと同旨の本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張の取
消事由１は理由がない。
２取消事由２（甲２を主引用例とする本件発明１の進歩性の判断の誤り）につ
いて
⑴甲２の記載事項について
ア甲２には，以下のような記載がある（下記記載中に引用する「図１及び
図５」並びに「表２」については別紙４を参照）。
(ア)「これまでのところ，コリネバクテリウム・グルタミカム（C.グル
タミカム）のプロモーターの構造に関しては限られた情報しか入手可能
ではなかった。…C.グルタミカム由来の新たに特徴づけられたプロモー
ター配列と共に公開されたプロモーターを比較分析することにより，保
存された配列は，TS（転写開始）サイト上流のおよそ35bp（ttGcca）及
び10bp（TA.aaT）であることが明らかになった。これらモチーフの位置
及びモチーフ自体は，他のグラム陽性及びグラム陰性細菌の-35及び-10
プロモーターコンセンサス配列に相当し，それらはC.グルタミカムでの
転写開始シグナルを表すことを示唆している。
しかし，C.グルタミカムは，-35領域のコンセンサスヘキサマー保存
量が，大腸菌…，バチルス…，ラクトバチルス…及び連鎖球菌…よりも
はるかに少ない。」（１２９７頁，要約１行～２０行）
(イ)「緒言…
C.グルタミカムは，特にさまざまなアミノ酸の生産菌として知られて
いるグラム陽性無芽胞微生物である。さまざまなC.グルタミカム遺伝子
の特徴が明らかにされてきたが…，遺伝子発現シグナルに関する知見は
未だ不十分であり，C.グルタミカムプロモーターの一般的構造，すなわ
ち典型的なコンセンサス配列は，今のところ定義されていない。…これ
までに得られているわずかなデータによれば，C.グルタミカムのプロモ
ーター配列は，大腸菌又は枯草菌と異なっているか，あるいは少なくと
もグラム陰性菌とグラム陽性菌両方に共通する典型的なプロモーターコ
ンセンサスパターンと低い一致を示す。
この試験では，C.グルタミカムから18個，溶原性コリネファージφ
GA1から4個のプロモーターを単離し…，各TS領域のマップを作成し
た。次に，新たに開発されたコンピュータプログラムを用いて，コリネ
バクテリウムのプロモーターコンセンサス配列を示す共通パターンを見
つけるために，以前報告されているプロモーター配列と合わせて，これ
らのプロモーター配列に関する比較解析を実施した。」（１２９７頁左
欄１行，１２９８頁左欄１２行～４４行）
(ウ)「C.グルタミカム及び大腸菌でのプロモーター活性の評価
クローン化されたプロモーターの相対強度は，CmのMICを定量し，さ
まざまなC．グルタミカムクローンの特異的なCAT活性を測定すること
によって評価した。…C.グルタミカム染色体及びファージφGA1から単
離されたフラグメント全てに，C.グルタミカムでも大腸菌でも機能した
プロモーターが含まれることが示された。」（１３００頁左欄３行～８
行，右欄１４行～１８行）
(エ)「プロモーター運搬フラグメントの配列決定及びTS部位のマッピ
ング
…図１に，プライマー伸長法…から推定されるように配列のプロモー
ター関連部を示している。
図１．TSサイトに従って並べられたC.グルタミカムプロモーターの
核酸配列。プロムスキャンプログラムにより同定された推定-35及び-10
領域に下線を引いた。hom，thrC，fda，lysA，ask，gdh，glt，gap，pgk，
及びtrpのプロモーター配列は，本文で参照したレファレンスより取得
した。」（１３００頁右欄１９行～２４行，１３０１頁左欄１行～２行，
図１）
(オ)「プロモーター配列の解析
…さらに，上のＳrel平均値を持つ２つ目のｋ文字パターンワード領域
が，-10領域の上流約20bpで検出された。この領域はこれ以降，-35領
域と呼ぶ。-10領域で最も多いヘキサマーはGGTATA，GGTACA，TATAAT及
びTACAATであり，-35領域で最も多いヘキサマーはTCTTGG，TTTTGC，
TTTGCC，TTGCCA，GGCCAA及びGCCAAAであった。…
少なくとも相関している位置での切断がある-10及び-35のモチーフ
を基点として，プロモーター配列のアライメントを行った。図５に示し
ているように，最もよく保存されている配列は-35領域のtttGcca.a及
び-10領域のggTA.aaTであった。図５からも，-35及び-10のコンセン
サス配列にある各塩基の保存量がかなり異なっていることがわかる。し
かし，これら２つのモチーフは，配列自体から明らかなC.グルタミカム
プロモーターの主な情報を運搬する領域の特徴を示していると結論づけ
ることができる。
図５．PROMSCANによってみられた-10領域及び-35領域を基点として
アライメントを行ったC.グルタミカムの塩基分布。切断は少なくとも相
関している位置で導入した。ヒストグラムには，各位置でも最も顕著な
塩基の発生数を示している。ヒストグラムの上に，同じ位置で少なくと
も42%（33個中14個）のプロモーターに発生している塩基を記載してい
る。同じ位置で70%（33個中23個）を超えるプロモーターに発生してい
る塩基は大文字で記載している。」（１３０２頁左欄９行，１３０４頁
右欄３行～１３０５頁左欄３行，同頁左欄２１行～右欄６行，図５）
(カ)ａ「考察
我々の試験の目的は，C.グルタミカムプロモーターを単離して分子
的特徴を明らかにすることにあった。プロモータープローブベクター
pEKplCmを用いて，多種多様なプロモーター活性DNAフラグメントを
単離することができた。試験した全18フラグメントは，E.coliにお
いてcatの転写を作動させ，単離されたプロモーターがこの生物にお
いても活性であったことが示唆される。この結果は予想できないもの
ではなかった。なぜなら，C.グルタミカムからクローン化された遺伝
子の多くは，適切な栄養要求体の異種相補性により示唆されるように
…，E.coliで発現したからである。反対に，いくつかのE.coli遺伝
子は，C.グルタミカムで効率的に出現し…，そしてE.colitac，
lacUV5，及びtrpプロモーターはコリネバクテリアで機能的であるこ
とが示されている…。これら全ての結果は，C.グルタミカムのプロモ
ーターの一般的構造は，E．coliのプロモーターのものと類似してい
ることを示唆する。しかしながら，コリネ型細菌特有のプロモーター
がE.coliでは明らかに機能しなかったという複数の報告もある…。」
（１３０５頁右欄７行～１３０６頁左欄２行）
ｂ「C.グルタミカム由来のプロモーターと他の細菌由来のプロモータ
ーの一次構造の類似性は，比較コンピュータ分析により立証された。
本研究で適用した両プログラムは，C.グルタミカムプロモーターの
我々のセットにおいて，最も関連する領域が，TS部位の上流10bp周
辺に位置し，ヘキサマーTA.AATを含むことを示した。当該または類似
のモチーフをすべてのプロモーターで見つけることができる。別の保
存領域はTS部位の上流およそ35pbで検出された。この領域で見いだ
されたコンセンサスヘキサマーTTGCCAは，E.coliのコンセンサス
TTGACAと，４番目の位置でのみ異なる。このTTGCCAモチーフはプロ
モーター33種のうち14種にしか明確に（３塩基対より大きいマッチ
ングで）は見出されず，その機能が明確ではない。他のいくつかのプ
ロモーターにおいては，このモチーフは容易に識別できず，C.グルタ
ミカムのプロモーターにおける，より低い保存性を示唆する。」（１
３０６頁左欄３行～１８行）
ｃ「しかしながら，TS部位に関連する位置から，スペーシング（17･
35bpの平均）から，及び２つの保存されたヘキサマーモチーフの配列
から，C.グルタミカムにおけるこれらのシグナルは，E.coli…及びそ
の他の真正細菌，e.g.バシラス…，ラクトバチルス…，及びストレプ
トコッカス…の-10及び-35プロモーターコンセンサス配列に相当す
ることが明らかである。我々の分析により明らかになったC.グルタミ
カムのコンセンサスモチーフの優位性は，tacプロモーター（12個の
位置中11がコンセンサスと同一）がC.グルタミカムで非常に効率的
であることが判明し…，並びにE.colilacプロモーターにおいて-10
ヘキサマーをTATGTTからTATATTへ変更し，コンセンサス配列との類
似性を高めることは，C.グルタミカムでのプロモーターのより高い効
率を導く…という事実により裏付けられる。」（１３０６頁左欄１８
行～３８行）
ｄ「-10及び-35ヘキサマーはさておき，その他の位置もC.グルタミ
カムプロモーターにおいて保存されているようである：-10エレメン
トの5’末端に隣接する二つのＧ,-35エレメントの2bp下流のＡ残基
及び-35エレメントの直ぐ上流のＴ残基（図５）。実際，-10及び-35
ヘキサマー付近の保存された塩基は，コンセンサスモチーフをggTA．
aaT及びtttGcca.aにそれぞれ拡張する。多数のバチルス及びラクト
バチルスのプロモーターにおいて，-10ヘキサマーの上流に又は1bp
隔てて見いだされたTGモチーフの存在により，伸張されたプロモー
ターコンセンサスがグラム陽性細菌で提案されている…。ここで分析
した33プロモーターのうち11が，-10ヘキサマーの5’近傍でTGモ
チーフを含む，したがって，-10ヘキサマーに隣接するTGダブレット
は，C.グルタミカムにおいても，プロモーター機能に有意性を有する
かもしれない。-10領域上流の比較的高いA+T含量も有意なようであ
る，特に，C.グルタミカムの平均A+T含量はほんの約43.5%だからで
ある…」（１３０６頁左欄３９行～５９行）
ｅ「例えばバチルス及びストレプトコッカスのようないくつかのグラ
ム陽性細菌では，殆どの-10及び-35プロモーター領域は，それらのコ
ンセンサス配列であるTATAAT及びTTGACAのそれぞれと，ほぼ完全に
一致する…。一方，本論文で研究したC.グルタミカムのプロモーター
のセットにおいて，これは当てはまらなかった。C.グルタミカムのプ
ロモーターのコンセンサスモチーフにおけるいくつかの塩基は，中程
度にしか保存されておらず（図５参照），全体として，比較的中程度
にしかモチーフが保存されていないことを示唆する。プロモーターの
コンセンサス配列の保存レベルは，所与の細菌における主要RNAポリ
メラーゼのσ因子の要求を反映している可能性があることから…，
我々の研究におけるポジションごとのコンセンサスの保存の程度を，
他の細菌からのプロモーターの編集物におけるものと比較することは
興味深い。表２に示すとおり，-35及び-10コンセンサスヘキサマーに
おけるほぼすべての塩基は，C.グルタミカムのプロモーターのセット
と比較して，バチルス，ラクトバチルス及びストレプトコッカスのプ
ロモーターでは非常に高く，E.coliプロモーターではかなり高く，保
存されていた。これらのデータは，リストした微生物における主要RNA
ポリメラーゼの認識特異性が，バチルス／ラクトバチルス／ストレプ
トコッカス＞E.coli＞C.グルタミカムの順で低下することを示唆す
る。」（１３０６頁右欄１８行～４２行）
ｆ「表２．異なる生物に由来するプロモーターのコンパイルでの，-35
及び-10モチーフにおけるコンセンサス保存の程度
異なる生物のプロモーターコンパイルを以下のレファレンスより取
得した：C.グルタミカム，33プロモーター（本研究）；E.coli，263プ
ロモーター…；バチルス・サブチリス，237プロモーター…；ラクトバ
チルス，30プロモーター…；ストレプトコッカス，17プロモーター…」
（１３０７頁，表２）
ｇ「E.coliにおけるプロモーターの活性は，-35及び-10コンセンサ
スヘキサマーとの類似性と大部分は相関し得るため…，我々は，観察
されたCAT活性は，所定のプロモーターと，予測コンセンサスプロモ
ーター配列との類似性スコアとおおよそ相関すると推測した。しかし
ながら，そのような相関は確認できなかった。」（１３０６頁右欄５
９行～１３０７頁左欄６行）
ｈ「本論文において提供したデータから明らかなとおり，C.グルタミ
カムにおけるプロモーター（又はプロモータークラス）の構造－機能
相関について詳細な情報を得て，それによりこの産業上重要な微生物
における遺伝子発現をより良く理解するためには，例えば，選択プロ
モーターの厳密な変異分析及び生化学的分析のようなさらなる研究が
必要であることが明らかである。」（１３０７頁右欄４行～１０行）
イ前記アの記載事項によれば，甲２には，以下の開示があると認められる。
(ア)C.グルタミカムの遺伝子発現シグナルに関する知見は未だ不十分で
あり，C.グルタミカムプロモーターの一般的構造，すなわち典型的なコ
ンセンサス配列は，今のところ定義されていない。これまでに得られて
いるわずかなデータによれば，C.グルタミカムのプロモーター配列は，
大腸菌又は枯草菌と異なっているか，あるいは少なくともグラム陰性菌
とグラム陽性菌両方に共通する典型的なプロモーターコンセンサスパタ
ーンと低い一致を示す（前記ア(イ)）。
(イ)この試験では，C.グルタミカムから18個，溶原性コリネファージφ
GA1から4個のプロモーターを単離し，各TS領域のマップを作成した
（前記ア(イ)）。
図１は，TSサイトに従って並べられたC.グルタミカムプロモーター
の核酸配列である（前記ア(エ)）。
図１には，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子のプロモ
ーター配列（「p-gdh」）の－３５領域に「TGGTCA」配列及び－１０領域
に「CATAAT」配列を有し，クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモー
ター配列「p-glt」の－３５領域に「TGGCTA」配列及び－１０領域に「TAGCGT」
配列を有することが示されている。
(ウ)試験した全18フラグメントは，E.coliにおいてcatの転写を作動
させ，単離されたプロモーターがこの生物においても活性であったこと
が示唆される（前記ア(カ)ａ）。
反対に，いくつかのE.coli遺伝子は，C.グルタミカムで効率的に出現
し，E.colitac，lacUV5，及びtrpプロモーターはコリネバクテリア
で機能的であることが示されている。これら全ての結果は，C.グルタミ
カムのプロモーターの一般的構造は，E．coliのプロモーターのものと
類似していることを示唆する。他方，コリネ型細菌特有のプロモーター
がE.coliでは明らかに機能しなかったという複数の報告もある（前記
ア(カ)ａ）。
(エ)本研究で適用したプログラムは，C.グルタミカムプロモーターのセ
ットにおいて，最も関連する領域が，TS部位の上流10bp周辺に位置す
ることを示した。また，別の保存領域はTS部位の上流およそ35pbで検
出された。
図５に示しているように，最もよく保存されている配列は-35領域の
ttGcca.a及び-10領域のggTA.aaTであった（前記ア(カ)ｂ）。
これらモチーフの位置及びモチーフ自体は，他のグラム陽性及びグラ
ム陰性細菌の-35及び-10プロモーターコンセンサス配列に相当し，そ
れらはC.グルタミカムでの転写開始シグナルを表すことを示唆してい
る。しかし，C.グルタミカムは，-35領域のコンセンサスヘキサマー保
存量が，大腸菌，バチルス，ラクトバチルス及び連鎖球菌よりもはるか
に少ない（前記ア(ア)）。
(オ)しかしながら，我々の分析により明らかになったC.グルタミカムの
コンセンサスモチーフの優位性は，tacプロモーター（12個の位置中11
がコンセンサスと同一）がC.グルタミカムで非常に効率的であることが
判明し，並びにE.coliのlacプロモーターにおいて-10ヘキサマーを
TATGTTからTATATTへ変更し，コンセンサス配列との類似性を高めるこ
とは，C.グルタミカムでのプロモーターのより高い効率を導くという事
実により裏付けられる（前記ア(カ)ｃ）。
(カ)一方，バチルス及びストレプトコッカスのようないくつかのグラム
陽性細菌では，殆どの-10及び-35プロモーター領域は，それらのコンセ
ンサス配列であるTATAAT及びTTGACAとほぼ完全に一致するのに対し，
本論文で研究したC.グルタミカムにこれは当てはまらず，C.グルタミカ
ムのプロモーターのコンセンサスモチーフにおけるいくつかの塩基は，
中程度にしか保存されていなかった（図５参照）（前記ア(カ)ｅ）。
表２に示すとおり，-35及び-10コンセンサスヘキサマーにおけるほ
ぼすべての塩基は，C.グルタミカムのプロモーターのセットと比較して，
バチルス，ラクトバチルス及びストレプトコッカスのプロモーターでは
非常に高く，E.coliプロモーターではかなり高く，保存されていた（前
記ア(カ)ｅ）。
(キ)E.coliにおけるプロモーターの活性は，-35及び-10コンセンサス
ヘキサマーとの類似性と大部分は相関し得るため，我々は，C．グルタミ
カムのCAT活性は，所定のプロモーターと，予測コンセンサスプロモー
ター配列との類似性スコアとおおよそ相関すると推測したが，そのよう
な相関は確認できなかった（前記ア(カ)ｇ）。
本論文において提供したデータから明らかなとおり，C.グルタミカム
におけるプロモーターの構造－機能相関について詳細な情報を得て，そ
れによりこの産業上重要な微生物における遺伝子発現をより良く理解す
るためには，更なる研究が必要であることが明らかである（前記ア(カ)
ｈ）。
⑵甲５の記載事項について
ア甲５には，次のような記載がある。
(ア)請求の範囲
「1.染色体上に存在するα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性
を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に
1又は2以上の塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じたことに
より，α－ケトグルタル酸デヒド口ゲナーゼ活性が欠損したコリネ型Ｌ
－グルタミン酸生産菌。
2.請求項1記載のコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を液体培地中に
培養し，培養液中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを採取する
ことを特徴とするＬ－グル夕ミン酸の製造法。」（５５頁２行～８行）
(イ)明細書
ａ「技術分野
本発明は，Ｌ－グルタミン酸…の発酵生産に用いられるコリネ型細
菌の育種と利用に関する。更に詳しくは，本発明は，α－ケトグルタ
ル酸デヒドロゲナーゼ（α－ＫＧＤＨ）活性が欠失したコリネ型Ｌ－
グルタミン酸生産菌，該菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造法…に関
する。」（１頁３行～１１行）
「背景技術
従来よりＬ－グルタミン酸はブレビバクテリウム属又はコリネバ
クテリウム属に属するコリネ型細菌を用いた発酵法により工業的に生
産されている。
近年，α－ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下し，かつＬ－グルタミ
ン酸分解活性が低下した大腸菌変異株が，高いＬ－グルタミン酸生産
能を持つことが明らかとなった…。
これに対し，ブレビバクテリウム属の細菌においては，α－ＫＧＤ
Ｈ活性の低下した変異株のＬ－グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じ
であったとの報告があり…，コリネ型細菌では，α－ＫＧＤＨ活性の
レベルはＬ－グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられてい
た。
一方，α－ＫＧＤＨ活性が低下し，かつＬ－グルタミン酸生産能を
有する変異株をビオチン過剰原料を炭素源とする培地中で培養すると，
ぺニシリン類や界面活性剤等のビオチン作用抑制物質を培地に添加す
ることなく，高収率でＬ－グルタミン酸が生産されることが見い出さ
れている…。しかしながら，上述したようにコリネ型細菌では，α－
ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ－グルタミン酸の生産に重要ではないもの
と考えられていたため，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌のα－ＫＧ
ＤＨ遺伝子をクローニングし解析した例はなかった。また，α－ＫＧ
ＤＨを欠失したコリネホルム細菌の変異株も知られていなかった。」
（１頁１２行～２頁５行）
ｂ「発明の開示
本発明の目的は，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌由来のα－ＫＧ
ＤＨ遺伝子を取得し，該遺伝子を含む組換えＤＮＡを作製し，該組換
えＤＮＡで形質転換した微生物を用いてα－ＫＧＤＨ活性のレベルが
Ｌ－グルタミン酸の発酵生産に及ぼす影響を明らかにし，もってコリ
ネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌の育種において新たな方法論を提供する
ことにある。より具体的には，本発明の目的は，染色体上に存在する
α－ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα－ＫＧＤＨ活性を欠失さ
せたコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を取得し，該菌を用いたＬ－グ
ルタミン酸の製造法を提供することにある。…
本発明者らは，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌由来のα－ＫＧＤ
Ｈ遺伝子を取得しその構造を明らかにするとともに，該遺伝子を組み
込んだ組換え体プラスミドでコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を形質
転換し，得られた形質転換体のα－ＫＧＤＨ活性のレベルとＬ－グル
タミン酸の生産能を調べた結果，α－ＫＧＤＨ活性がＬ－グルタミン
酸の生産に顕著な影響を及ぼすことを見いだした。また，本発明者ら
は，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌において染色体上に存在するα
－ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα－ＫＧＤＨ活性を欠失させ
た株が，過剰量のビオチンを含有する培地に培養する際，界面活性剤
やぺニシリンのようなビオチン作用抑制物質を培地に添加することな
く著量のＬ－グルタミン酸を生成蓄積することを見いだした。」（２
頁６行～２７行）
ｃ「すなわち，本発明は，
(1)染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードす
る遺伝子又はそのプロモー夕ーの塩基配列中に１又は２以上の塩基の
置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じたことにより，α－ＫＧＤＨ
活性が欠損したコリネ型Ｌ－グル夕ミン酸生産菌，
(2)上記(1)記載のコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を液体培地中に
培養し，培養液中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを採取す
ることを特徴とするＬ－グルタミン酸の製造法，
…を提供するものである。」（３頁３行～１８行）
ｄ(a)「α－ＫＧＤＨ活性が欠失した株の取得は，化学薬剤を用いて変
異を誘導する方法でも，遺伝子組換えによる方法でも取得可能であ
る。しかし，化学薬剤による変異誘導法ではα－ＫＧＤＨ活性が低
下した株を得ることは比較的容易であるが該活性が完全に欠失し
た株の取得は困難であり，このような株を取得するには上記のよう
にして明らかとなったα－ＫＧＤＨ遺伝子の構造を基に，遺伝子相
同組換え法により染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ遺伝子を改変
又は破壊する方法が有利である。相同組換えによる遺伝子破壊は既
に確立しており直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性プラスミド
を用いる方法などが利用できる。
具体的には，部位特異的変異法…や次亜硫酸ナトリウム，ヒドロ
キシルアミン等の化学薬剤による処理…によって，α－ＫＧＤＨ遺
伝子のコーディング領域又はプロモーター領域の塩基配列の中に
１つ又は複数個の塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位を起こさ
せ，このようにして改変又は破壊した遺伝子を染色体上の正常な遺
伝子と置換することにより遺伝子産物であるα－ＫＧＤＨの活性
を欠失させるかα－ＫＧＤＨ遺伝子の転写を消失させることがで
きる。」（８頁２４行～９頁１０行）
⒝「このようにして取得した変異が導入されて改変又は破壊された
遺伝子をコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌の染色体上の正常な遺伝
子と置換する方法としては，相同性組換えを利用した方法…がある。
相同性組換えは，染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラ
スミド等が菌体内に導入されると，ある頻度で相同性を有する配列
の箇所で組換えを起こし，導入されたプラスミド全体を染色体上に
組み込む。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組
換えを起こすと，再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが，こ
の時組換えを起こす位置により変異が導入された遺伝子の方が染色
体上に固定され，元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上
から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより，
塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位を持つ変異が導入されて改
変又は破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌
株を取得することができる。」（９頁２９行～１０頁１３行）
⒞「かくして得られるα－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型Ｌ－グ
ルタミン酸生産菌は，α－ＫＧＤＨ活性が部分的に低下した株に比
ベて特に過剰量のビオチンを含有する培地においてＬ－グルタミン
酸生産能が顕著に優れている。」（１０頁１４行～１６行）
ｅ(a)「なお，Ｌ－グルタミン酸生産性を向上させるには，グルタミン
酸生合成系遺伝子を強化することが有利である。グルタミン酸生合
成系遺伝子を強化した例としては，解糖系のホスフォフルクトキナ
ーゼ（ＰＦＫ…），アナプレロティック経路のホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ…），ＴＣＡ回路のクエン酸合
成酵素（ＣＳ…），アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣＯ…），イソ
クエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ…），アミノ化反応としては
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ…）等がある。」（１１頁
１１行～２０行）
⒝「上記の遺伝子を取得するためには以下に示す様な方法が考えら
れる。
(1)目的遺伝子に変異が起こり特徴的な形質を示す変異株で，目
的遺伝子を導入することによりその形質が消失するような変異株
を取得し，その変異株の形質を相補するような遺伝子をコリネ型細
菌の染色体から取得する方法。
(2)目的遺伝子が他の生物において既に取得され塩基配列が明ら
かになっている場合，相同性の高い領域のＤＮＡをプローブとして
ハイブリダイゼーションの手法により目的の遺伝子を取得する方
法。
(3)目的遺伝子の塩基配列がかなり詳細に判明している場合は目
的遺伝子を含む遺伝子断片をコリネ型細菌の染色体を鋳型としＰ
ＣＲ法…により取得する方法。
ここで用いる染色体の取得方法は上記の方法を用いることがで
きる。また，宿主－べクター系としては，コリネ型細菌で利用可能
なものであればよく，上記で述べたものが用いられる。本発明の実
施例においては塩基配列が既に明らかになっている場合に有効で
ある上記(3)の方法を用いた。
また，上記(2)及び(3)の方法で遺伝子を取得する場合，目的遺伝
子が独自のプロモーターを持たない時にはコリネ型細菌でプロモ
ーター活性を持つＤＮＡ断片を目的遺伝子の上流に挿入すること
により目的遺伝子を発現させることができる。目的遺伝子の発現を
強化するには，強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連結する
ことが考えられる。コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーター
のうち強力なものとしては，大腸菌のｌａｃプロモーター，ｔａｃ
プロモーター，ｔｒｐプロモーター等がある…。また，コリネバク
テリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターであ
る…。本発明の実施例においては，ＰＥＰＣ遺伝子の発現にコリネ
型細菌のｔｒｐプロモーターを用いた。」（１１頁２１行～１２頁
１６行）
ｆ(a)「発明を実施するための最良の形態
以下，実施例により本発明をさらに具体的に説明する。」（１４
頁１５行～１６行）
⒝「実施例３α－ＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製
α－ＫＧＤＨ遺伝子増幅によりＬ－グルタミン酸生成が抑制され
たことから，逆にα－ＫＧＤＨ遺伝子を破壊する事によりグルタミ
ン酸収率を向上させることが期待された。遺伝子破壊株は，特開平
５－７４９１号に示される温度感受性プラスミドを用いた相同組
換え法により取得した。」（２３頁１８行～２２行）
⒞「実施例４ｇｄｈ，ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子増幅用プラスミ
ドの作製」（２４頁２６行）
⒟「実施例７ｐＧＤＨ，ｐＧＬＴＡ，ｐＰＰＣ，ｐＩＣＤ，ｐＧ
ＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各
遺伝子の発現の確認
ｐＧＤＨ，ｐＧＬＴＡ，ｐＰＰＣ，ｐＩＣＤ，ｐＧＤＨ＋ＧＬＴ
Ａ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子がブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞内で発現し，これら
のプラスミドが遺伝子増幅の機能を果たしていることの確認を行
った。」（２８頁１行～６行）
ｇ「産業上の利用性
コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌のα－ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ
－グルタミン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。従
って，薬剤遺伝子の挿入等によるα－ＫＧＤＨ遺伝子活性欠失株の取
得，invitro変異による活性弱化株の取得，プロモーターの改変によ
る発現低下株の取得等により，従来のコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産
菌と比較してさらにＬ－グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よ
く育種することが可能となる。」（３３頁１２行～１８行）
イ前記アの記載事項によれば，甲５には，以下の開示があると認められる。
(ア)近年，α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α－ＫＧＤＨ。以下，
単に「α－ＫＧＤＨ」ということがある。）活性が欠損又は低下し，か
つＬ－グルタミン酸分解活性が低下した大腸菌変異株が，高いＬ－グル
タミン酸生産能を持つことが明らかとなったが，コリネ型細菌では，α
－ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ－グルタミン酸の生産に重要ではないと考
えられていたため，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌のα－ＫＧＤＨ遺
伝子をクローニングし解析した例はなく，α－ＫＧＤＨを欠失したコリ
ネホルム細菌の変異株も知られていなかった（前記ア(イ)ａ）。
(イ)本発明者らは，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌由来のα－ＫＧＤ
Ｈ遺伝子の活性が，Ｌ－グルタミン酸の生産に顕著な影響を及ぼすもの
であり，このα－ＫＧＤＨ活性を欠失させた株が，著量のＬ－グルタミ
ン酸を生成蓄積することを見いだした。「本発明」の目的は，染色体上
に存在するα－ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα－ＫＧＤＨ活性
を欠失させたコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を取得し，該菌を用いた
Ｌ－グルタミン酸の製造法を提供することにある（前記ア(イ)ｂ）。
(ウ)「本発明」は，①コリネ型Ｌ－グル夕ミン酸生産菌の染色体上に存
在するα－ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプロ
モーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換，欠失，挿入，付加
又は逆位を生じさせて，α－ＫＧＤＨ活性を欠損させ，②上記①のコリ
ネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し，培養液中にＬ－グ
ルタミン酸を生成蓄積させ，これを採取することを特徴とするＬ－グル
タミン酸の製造法等を提供するものである（前記ア(ア)，同(イ)ｃ）
(エ)コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌のα－ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ
－グルタミン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなったため，
薬剤遺伝子の挿入等によるα－ＫＧＤＨ遺伝子活性欠失株の取得，in
vitro変異による活性弱化株の取得，プロモーターの改変による発現低
下株の取得等により，従来よりもＬ－グルタミン酸生産能が向上した菌
株を効率よく育種することが可能となる（前記ア(イ)ｇ）。
(オ)なお，Ｌ－グルタミン酸生産性を向上させるには，グルタミン酸生
合成系遺伝子を強化することが有利であり，グルタミン酸生合成系遺伝
子を強化した例としては，ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵素（ＣＳ），ア
ミノ化反応としてはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）等がある
（前記ア(イ)ｅ）。
⑶甲６の記載事項について
ア甲６（EMBOj.（1982）1（7））には，次のような記載がある。
「野生型と比較してプロモーター強度が２１倍に増強した６つの変異体
は，－３５プロモーター領域において，TTGTCAからコンセンサス配列
TTGACAに変異されていた。野生型より７倍強いampCプロモーターを示す
３つの変異体において，－１０領域配列TACAATは，コンセンサス配列
TATAATに変異されていた。」（８７５頁，要約４行～１０行）
「－３５領域の非常に保存されたTTG配列の下流には，３つのより厳密
でない保存されたヌクレオチドが続く。」（８７５頁左欄４０行～４２行）
イ前記アの記載事項によれば，甲６には，大腸菌において，－３５領域の
TTGTCA配列がコンセンサス配列TTGACAに変異した変異体では，プロモー
ター強度が２１倍に増強したこと，－１０領域のTACAAT配列がコンセン
サス配列TATAATに変異した変異体では，プロモーター強度が７倍に増強
したこと，－３５領域にTTG配列が保存されていることの開示がある。
⑷甲８の記載事項について
ア甲８（特開平３－１４７７９２号公報）には，次のような記載がある。
(ア)特許請求の範囲
「１．ＴＡＧＡＣＡで示される塩基配列（ａ）と，該塩基配列（ａ）
の１５～２０塩基対下流のＴＡＴＡＡＴで示される塩基配列（ｂ）とを
有することを特徴とするコリネ型細菌細胞内でプロモーターとして機能
するＤＮＡ断片（ｃ）。」（１頁左欄５行～９行）
(イ)発明の詳細な説明
「実施例２
合成プロモーターのｐＰＲ３への導入：
プロモーターはＤＮＡ合成装置…を用いて合成した（その両末端がＢ
ａｍＨＩ断片になるようにした）。そのＤＮＡ断片の塩基配列を下記に
示す。
実施例１で調製したプラスミドｐＰＲ３０．５μｇに制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ，プラスミドＤＮＡ
を完全に分解した。
上記合成プロモーターＤＮＡとプラスミドＤＮＡ解物を混合し，制限
酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理した後，該失活溶液
中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６，１０
ｍＭＭｇＣｌ２，１．０ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ及び
Ｔ４リガーゼ１ｕｎｉｔｓになるように各成分を強化し，１６℃で１５
時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＨＢ１０１コンピ
テントセル（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）のカナマイシンを含むＬ培
地（トリプトン１０ｇ，酵母エキス５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，純水１ｌ，ｐ
Ｈ７．２）で３７℃にて２４時間培養し，生育株として得られた。これ
ら生育株のプラスミドをアルカリ－ＳＤＳ法…により抽出した。
得られたプラスミドは実施例１の（Ｅ）項に記載の方法に従い，ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３株（ＦＥＲＭＢＰ－１４９７）
プラスミド除去株へ形質転換し，実施例１の（Ａ）項に記載の方法を用
いてプラスミドを抽出した。
このプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ等の制限
酵素による切断パターンによってｐＰＲ３に合成ＤＮＡが組み込まれて
いることを確認し，このプラスミドを“ｐＰＲ３ＢＴ２”と命名した。
実施例３
合成プロモーター強度の測定：
実施例２でｐＰＲ３に挿入したプロモーターの強度を，クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定すること
によって調べた。
ｐＰＲ３を保有するブレビバクテリウムフラバムＭＪ－２３３株と
ｐＰＲ３ＢＴ２を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３
株をそれぞれ，実施例１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａにカナマイシ
ンを５０μg／ml加えた培地１０m1の入った試験管で一晩前培養し，そ
の培養液を上記の培地１００mlの入った三角フラスコで約６時間培養
後集菌し，活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．Ｖ．Ｓｈａｗらの方
法…により測定した。その結果，ｐＰＲ３ＢＴ２を有するＭＪ－２３３
株は，プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有するＭＪ－２３３
株の約１４倍のＣＡＴ活性をもっていた。」（６頁右上欄１３行～７頁
左上欄１１行）
イ前記アの記載事項によれば，甲８には，－１０領域にTATAAT配列を有す
るプロモーターがコリネ型細菌で機能し，目的遺伝子の発現を１４倍に高
めたことの開示がある。
⑸相違点の容易想到性について
ア取消事由２－１（本件発明１－１について）
(ア)主引用例（甲２）の記載事項
ａ前記⑴イのとおり，甲２には，C.グルタミカムプロモーターの核酸
配列（図１）が記載されており，コリネ型細菌の染色体上の，ＧＤＨ
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に「TGGTCA」配列及び－１０
領域に「CATAAT」配列を有し，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３
５領域に「TGGCTA」配列及び－１０領域に「TAGCGT」配列を有するこ
とが示されている。また，甲２には，C.グルタミカムプロモーターの
セットにおいて，最もよく保存されている配列は-35領域の「ttGcca.a」
及び-10領域の「ggTA.aaT」であることが記載されている（図５）。
一方，甲２には，コリネ型細菌を用いた発酵法によるグルタミン酸
の製造方法において，グルタミン酸生合成系遺伝子であり，コリネ型
細菌の染色体上の特定の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子の
プロモーター配列について，その－３５領域及び－１０領域の塩基配
列をコリネ型細菌のコンセンサス配列に改変することの動機付けとな
るような記載はない。
したがって，甲２発明に接した当業者は，甲２の原告ら指摘箇所を
認識していたとしても，甲２発明において，ＧＤＨ遺伝子のプロモー
ター配列の－３５領域及び－１０領域の配列と目的遺伝子の発現量の
強化の程度及びそれによるグルタミン酸生産能の向上との関係に着目
し，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を得るため
に，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域の
配列を本件発明１－１の配列に置換する動機付けはないから，当業者
は上記構成を容易に想到できたものとは認められない。
ｂこれに対し原告らは，①Ｌ－グルタミン酸の生産を増強するために
は，Ｌ－グルタミン酸に至るまでの各反応に関与する酵素（ＣＳ，Ｇ
ＤＨ，ＩＣＤＨ等）の発現を強化することが望ましいことは，本件優
先日前において技術常識であったこと，②E.coliにおいて，プロモー
ターの－１０領域及び－３５領域をコンセンサス配列に変更ないし近
づけることによって，目的遺伝子の発現を強化できることも，本件優
先日前において技術常識であったこと，③甲２には，コリネ型細菌と
E.coliのコンセンサス配列が同等であることや，コリネ型細菌のプロ
モーターの－１０領域のコンセンサス配列が「TA.aaT」であり，この
３番目の塩基「.」として，相対的に「T」が最も頻度が高いことが記
載されていることからすると，甲２の記載は，当業者に対し，甲２発
明のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域（CATAAT）の１番
目の塩基「C」を「T」に変異して，コンセンサス配列，すなわち本件
発明１－１の構成（「TATAAT」）とし，同－３５領域（「TGGTCA」）
の１番目～３番目の塩基を保存性の高い「TTG」にするために，２番目
の塩基「G」を「T」に変異して，本件発明１－１の構成（「TTGTCA」）
とすることを示唆するものである旨主張する。
しかしながら，仮に，本件優先日前において，Ｌ－グルタミン酸の
生産を増強するために，Ｌ－グルタミン酸の生成反応に関与する酵素
（ＣＳ，ＧＤＨ，ＩＣＤＨ等）の発現を強化することが望ましいこと
が知られていたとしても，当該酵素の遺伝子を増強する具体的な方法
は，相当多数のものが想定し得たものと考えられるのであって，かか
る方法として，本件発明１のように，目的遺伝子のプロモーターの特
定の領域に変異を導入する方法が知られていたことは認められない。
また，E.coliにおいて，プロモーターの－１０領域及び－３５領域
をコンセンサス配列に変更ないし近づけることによって，目的遺伝子
の発現を強化できる場合があることが，本件優先日前において知られ
ていたとしても，コリネ型細菌について，これと同様の知見が存在し
ていたことを認めるに足りる証拠はない。かえって，前記⑴イのとお
り，甲２には，C．グルタミカムにおけるプロモーターの活性と-35及
び-10のコンセンサス配列との類似性の間には，E.coliと異なり，相
関は確認できなかった旨が記載されている。
したがって，原告らの上記主張は採用することができない。
(イ)甲５の記載事項との組合せ
ａ前記⑵イ(オ)のとおり，甲５には，Ｌ－グルタミン酸生産性を向上
させるには，グルタミン酸生合成系遺伝子を強化することが有利であ
り，グルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例として，ＣＳ，ＧＤＨ
等があることが記載されている。
他方，甲５において，ＣＳ，ＧＤＨ等を増強する方法として具体的
な開示があるのは，これらの遺伝子を染色体から取得し，これをコリ
ネ型細菌で利用可能なベクターに連結した後，目的遺伝子の発現を増
強したい場合には，ベクター上の遺伝子を強力なプロモーターの下流
に連結することにとどまる。
また，甲５には，α－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型細菌を得る
方法として，染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド
を用いて相同性組換えを起こすことにより，変異が導入されて改変又
は破壊された遺伝子が，染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を
取得することができる旨が記載されている（前記⑵ア(イ)ｄ(a)，⒝）。
しかしながら，かかる記載は，α－ＫＧＤＨ活性を欠損させる手段
として記載されているに過ぎず，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺
伝子等のグルタミン酸生合成系の酵素活性を増強する手段として記載
されているわけではない。
そして，そのほかに，甲５には，グルタミン酸生合成系遺伝子であ
り，コリネ型細菌の染色体上の特定の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子及び
ＣＳ遺伝子のプロモーター配列について，その－３５領域及び－１０
領域の塩基配列をコリネ型細菌のコンセンサス配列に改変することの
動機付けとなるような記載はない。
したがって，甲２発明に接した当業者は，甲５の記載を認識してい
たとしても，甲２発明において，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の
－３５領域及び－１０領域の配列と目的遺伝子の発現量の強化の程度
及びそれによるグルタミン酸生産能の向上との関係に着目し，グルタ
ミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を得るために，ＧＤＨ
遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域に本件発明１
－１の配列を導入する動機付けはないから，当業者は上記構成を容易
に想到できたものとは認められない。
ｂこれに対し原告らは，Ｌ－グルタミン酸の生産量を向上させる目的
で，ＴＣＡ回路に関わるＧＤＨ遺伝子の発現を強化するため，甲２発
明に対し，甲５記載のlacプロモーター等の－１０領域（「TATAAT」）
を適用し，甲２発明の染色体上のプロモーターに変異を導入して，相
違点１に係る本件発明１－１の構成を採用することは，当業者が容易
に想到し得たものである旨主張する。
しかしながら，甲５において，ＣＳ，ＧＤＨ等を増強する方法とし
て開示されているのは，これらの遺伝子を染色体から取得し，これを
コリネ型細菌で利用可能なベクターに連結した後，目的遺伝子の発現
を増強したい場合には，ベクター上の遺伝子を強力なプロモーターの
下流に連結することにとどまることについては，前記ａのとおりであ
る。
したがって，原告らの上記主張は採用することができない。
(ウ)甲６の記載事項との組合せ
甲６の開示事項については，前記⑶イのとおりである。
一方，甲６は，コリネバクテリウム・グルタミカムのプロモーターに
関する文献ではなく，特定の遺伝子のプロモーターの配列とプロモータ
ー活性の関係を調べた結果が記載されているだけであって，コリネバク
テリウム・グルタミカムのプロモーターの－３５領域及び－１０領域の
コンセンサス配列について，開示ないし示唆するものではない。
したがって，前記(ア)及び(イ)と同様に，甲２発明に接した当業者は，
甲６の記載を認識していたとしても，甲２発明において，ＧＤＨ遺伝子
のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域に本件発明１－１の配
列を導入する動機付けはないから，当業者は上記構成を容易に想到でき
たものとは認められない。
(エ)甲８の記載事項との組合せ
甲８の開示事項については，前記⑷イのとおりである。
一方，甲８は，コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモータ
ーに関する文献ではなく，特定の配列を有するプロモーターとプロモー
ター活性の関係を調べた結果が記載されているだけであって，コリネバ
クテリウム・グルタミカムのプロモーターの－３５領域及び－１０領域
のコンセンサス配列について，開示ないし示唆する記載はない。
したがって，前記(ア)及び(イ)と同様に，甲２発明に接した当業者は，
甲８の記載を認識していたとしても，甲２発明において，ＧＤＨ遺伝子
のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域に本件発明１－１の配
列を導入する動機付けはないから，当業者は上記構成を容易に想到でき
たものとは認められない。
イ取消事由２－２（本件発明１－２について）
前記アと同様の理由により，甲２発明に接した当業者は，甲２の原告ら
指摘箇所や，甲５，甲６又は甲８の記載を認識していたとしても，甲２発
明において，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域の配列と目的遺伝子
の発現量の強化の程度及びそれによるグルタミン酸生産能の向上との関
係に着目し，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を得る
ために，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域に本件発明１－２の配列
を導入する動機付けはないから，当業者は上記構成を容易に想到できたも
のとは認められない。
したがって，本件発明１－２は，甲２発明に基づいて，当業者が容易に
発明をすることができたものであるとはいえない。
ウ取消事由２－３（本件発明１－３について）
本件発明１－３は，本件発明１－１及び１－２の発明特定事項を更に限
定したものである。
したがって，前記ア及びイと同様の理由により，本件発明１－３は，甲
２発明に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであると
はいえない。
エ小括
以上によれば，甲２発明及び甲２の記載中の示唆に基づいて，又は甲２
発明に甲５，甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発明１の構成を
採用することは，当業者が容易に想到し得たものであるとはいえない。
したがって，これと同旨の本件審決の判断に誤りはなく，原告ら主張の
取消事由２は理由がない。
３取消事由３（甲５を主引用例とする本件発明１の進歩性の判断の誤り）につ
いて
⑴取消事由３－１（本件発明１－１について）
原告らは，本件審決における甲５発明の認定に誤りがある，また，仮に同
認定に誤りがないとしても，相違点の容易想到性の判断に誤りがある旨主張
する。そこで，かかる主張の当否について検討する。
ア甲５に記載された発明
(ア)甲５の記載事項（前記２⑵ア(ア)及び(イ)ｃ）によれば，甲５には，
本件審決が認定した甲５発明が記載されているものと認められる。
(イ)これに対し原告らは，甲５に記載された発明として，以下の甲５発
明’を認定すべきである旨主張する。
「コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
又はクエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列に変異を導入
したコリネ型細菌を培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄
積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－
グルタミン酸の製造方法。」
そして，原告らは，その根拠となる甲５の記載として，①９頁２９行
～１０頁１３行（前記２⑵ア(イ)ｄ⒝）及び②１１頁１１行～２０行（前
記２⑵ア(イ)ｅ(a)）を挙げる。
しかしながら，上記②の記載は，グルタミン酸生合成系遺伝子を強化
した例として，ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵素（ＣＳ），グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を挙げているに過ぎず，これらの遺伝子を
強化する具体的な方法を記載したものではない。
また，上記①の記載は，その前後の記載（前記２⑵ア(イ)ｄ）に鑑み
ると，化学薬剤による変異誘導法では得ることが困難な，α－ＫＧＤＨ
活性が完全に欠失した株を取得する方法として，遺伝子相同組換え法に
より染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ遺伝子を改変又は破壊する方法が
有利であることを記載したものであると理解できる。
以上によれば，上記①及び②の記載を考慮しても，甲５には，相同組
換えによる染色体への変異の導入は，α－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリ
ネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を得る手段として記載されているにとどま
り，クエン酸合成酵素(ＣＳ)，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)
を増強する手段として記載されているとはいえない。
したがって，原告らの上記主張は，採用することができない。
イ本件発明１－１と甲５発明の対比
本件発明１－１と甲５発明を対比した場合の一致点及び相違点は，本件
審決の認定（前記第２の３⑷イ及びウ）どおりであると認められる。
ウ相違点の容易想到性
前記２⑸(イ)のとおり，甲５には，Ｌ－グルタミン酸生産性を向上させ
るには，グルタミン酸生合成系遺伝子を強化することが有利であり，グル
タミン酸生合成系遺伝子を強化した例として，ＣＳ，ＧＤＨ等があること
が記載されているものの，ＣＳ，ＧＤＨ等を増強する方法として開示され
ているのは，これらの遺伝子を染色体から取得し，これをコリネ型細菌で
利用可能なベクターに連結した後，目的遺伝子の発現を増強したい場合に
は，ベクター上の遺伝子を強力なプロモーターの下流に連結することにと
どまるのであって，そのほかに，グルタミン酸生合成系遺伝子であり，コ
リネ型細菌の染色体上の特定の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝
子のプロモーター配列について，その－３５領域及び－１０領域の塩基配
列をコリネ型細菌のコンセンサス配列に改変することの動機付けとなる
ような記載はない。
したがって，甲５発明に接した当業者は，甲５の原告ら指摘箇所や，甲
２，甲６又は甲８の記載を認識していたとしても，甲５発明において，Ｇ
ＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域の配列と目
的遺伝子の発現量の強化の程度及びそれによるグルタミン酸生産能の向
上との関係に着目し，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異
株を得るために，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１
０領域に本件発明１－１の配列を導入する動機付けはないから，当業者は
上記構成を容易に想到できたものとは認められない。
⑵取消事由３－２（本件発明１－２について）
前記⑴ア及びイと同様の理由により，本件審決における甲５発明の認定及
び本件発明１－２と甲５発明の対比について，誤りはないと認められる。
また，前記⑴ウと同様の理由により，甲５発明に接した当業者は，甲５の
原告ら指摘箇所や，甲２，甲６又は甲８の記載を認識していたとしても，甲
５発明において，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域の配列と目的遺伝
子の発現量の強化の程度及びそれによるグルタミン酸生産能の向上との関係
に着目し，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を得るため
に，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域に本件発明１－２の配列を導入
する動機付けはないから，当業者は上記構成を容易に想到できたものとは認
められない。
⑶取消事由３－３（本件発明１－３について）
本件発明１－３は，本件発明１－１及び１－２の発明特定事項を更に限定
したものである。
したがって，前記⑴及び⑵と同様の理由により，本件発明１－３は，甲５
発明に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるとはい
えない。
⑷小括
以上のとおり，甲５の記載から甲５発明を認定することができ，また，本
件発明１－１と甲５発明及び本件発明１－２と甲５発明を対比した場合の一
致点及び相違点は，前記第２の３⑷イ及びウのとおりであると認められる。
そして，甲５発明及び甲５の記載中の示唆に基づいて，又は甲５発明に甲２，
甲６又は甲８記載の発明等を適用して，本件発明１の構成を採用することは，
当業者が容易に想到し得たものであるとはいえない。
したがって，これと同旨の本件審決の認定及び判断に誤りはなく，原告ら
主張の取消事由３は理由がない。
４取消事由４（本件発明２及び４の進歩性，サポート要件及び実施可能要件の
判断の誤り）について
⑴本件発明２について
本件発明２は，本件発明１－２と実質的に同一の発明である。
したがって，前記１ないし３と同じ理由により，本件発明２は，甲２発明
又は甲５発明に基づき，当業者が容易に発明をすることができたものである
とは認められず，かつ，サポート要件及び実施可能要件に適合するものであ
ると認められる。
⑵本件発明４について
本件発明４は，本件発明１を引用して，本件発明１－１及び本件発明１－
２の内容を更に限定した発明である。
したがって，前記１ないし３と同じ理由により，本件発明４は，甲２発明
又は甲５発明に基づき，当業者が容易に発明をすることができたものである
とは認められず，かつ，サポート要件及び実施可能要件に適合するものであ
ると認められる。
⑶小括
以上によれば，前記⑴及び⑵の判断と同旨の本件審決の判断に誤りはない
から，原告ら主張の取消事由４は理由がない。
５結論
以上のとおり，原告ら主張の取消事由１ないし４は，いずれも理由がなく，
本件審決にこれを取り消すべき違法は認められない。
したがって，原告らの請求は棄却されるべきものである。
知的財産高等裁判所第３部
裁判長裁判官
鶴岡稔彦
裁判官
上田卓哉
裁判官
山門優
（別紙１）
表１２
（別紙２）
（別紙３）
第２表
第１０表
第１１表
第１３表
（別紙４）
図１
図５
表２
＊C.グルタミカム-35コンセンサス配列において，４番目のヌクレオチドはAで
はなくCである。この位置でのAは，33プロモーターのうち7のみで見られた
（21%保存）。
発生数

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